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産品服務

Sequencing services

全轉錄組

          全轉錄組高通量測序,采用去核糖體鍊特異性建庫方法和小片段富集篩選建庫方法,可實現編碼RNA和非編碼RNA的建庫、測序、信息分析及聯合分析、ceRNA等,從而快速全面準确地獲得與特定生物學過程(例如發育、疾病等)所有大RNA轉錄本數據信息,這一項研究将調控機制研究延伸到“ 網、多層面”結合的立體模式,有助于相對全面解讀生物學現象。

推薦方案

推薦兩種測序策略方案:

1) 經濟型模式-兩種文庫測序:LncRNA-Seq + Small RNA

大RNA研究:采用LncRNA-Seq測序模式,即采用去核糖體鍊特異性建庫模式,進行PE100測序模式,10G Clean data;實現lncRNA、mRNA、circRNA鑒定和定量、以及功能分析;

小RNA研究:采用富集小RNA片段建庫方法,進行有方向性的SE50測序模式,20M clean reads,實現miRNA、siRNA以及piRNA鑒定和定量,以及功能分析等;

2) 大容量模式-三種文庫測序:LncRNA-Seq+ Small RNA+ CircRNA

大RNA研究:采用LncRNA-Seq測序模式,即采用去核糖體鍊特異性建庫模式,進行PE100測序模式,10G Clean data;實現lncRNA、mRNA、鑒定和定量、以及功能分析;

環狀RNA研究:采用去除線性RNA,反向富集環狀RNA建庫方法,進行PE100測序模式,10G clean data,對環狀RNA高深度測序,實現對低豐度的環狀RNA鑒定和定量及功能分析;

小RNA研究:采用富集小RNA片段建庫方法,進行有方向性的SE50測序模式,20M clean reads,實現miRNA、siRNA以及piRNA鑒定和定量,以及功能分析等; 

以上兩種模式,還可以實現大RNA和小RNA互作網絡分析,以及内源競争性RNA鑒定和網絡分析。


生物分析思路圖

全轉錄組流程圖


産品優勢

實驗嚴謹

建庫工藝穩定,技術重複性高,可接受多種類型樣本,total RNA最低起始量低至400ng;

分析全面

包含RNA互作模式,及ceRNA競争網絡分析等,從平面調控研究延伸至立體調控研究;

數據交互

采用Dr.Tom多組學數據挖掘系統,10大數據庫注釋,多維度結果圖片展示,數據圖表循環挖掘;

質控嚴格

實驗操作及信息分析操作采用全方位及現金的質量管理體系标準。


産品應用

動植物生長發育的研究

抗逆、抗病蟲害調控機理的研究

細胞分化和發育的研究

腫瘤發生發展及轉移研究



案例一:biomarker及内源性競争RNA調控研究——鑒定宮頸癌lncRNA和環狀RNA等biomarker及ceRNA分析[1]

研究目的:研究宮頸癌lncRNA和環狀RNA緻病分子調控機制

研究樣本:選取3個病人(HPV16)的宮頸鱗癌組織和癌旁組織。三個生物學重複樣本混樣(患病 vs 正常)

樣本處理: 選取癌組織旁邊2cm的癌旁組織,切除後即加入RNA later保護劑中30分鐘,随後放入液氮中冷藏。

研究技術: 經濟型模式-兩種文庫測序:

                 *去核糖體建庫測序方式-研究mRNA、lncRNA、環狀RNA;

                  *小片段建庫測序方法-研究miRNA;

研究結果:共鑒定到差異表達的19個lncRNA,99個環狀RNA,以及304個mRNA  非編碼RNA中鑒定到3個新lncRNA和44個新環狀RNA,并對這些差異RNA進行功能富集分析。另外,共表達分析和功能預測中,發現19個差異表達lncRNA在緻癌和癌症發展中具有重要作用,ceRNA網絡分析表達和非表達RNA的相互作用,研究每一個miRNA靶向作用的lncRNA和Mrna競争關系。發現一些miRNA可以靶向未知的lncRNA,說明這些非編碼RNA可能與宮頸癌有關。

研究結論:此次研究結果表明,非編碼RNA将有可能作為宮頸鱗癌治療和診斷的biomarker。CeRNA網絡研究在未來宮頸鱗癌研究中将對編碼RNA和非編碼RNA的關系及重要作用研究的将是重要的分析工具。                                                                                                   fmicb-08-01720-g005

                                     圖1 CeRNA網絡分析,包含lncRNA、miRNA和mRNA.

                                  (A)包含所有lncRNA/miRNA和miRNA/mRNA互作關系

                         (B) lncRNA-LNC_000188的ceRNA競争網絡. (C)LNC_000231的ceRNA競争網絡. 

                                       每個節點的大小與每個節點的計算功能連接性成比例


案例二:biomarker及内源性競争RNA調控研究——鑒定宮頸癌lncRNA和環狀RNA等biomarker及ceRNA分析[2]

研究目的:研究非編碼RNA參與調控次級毛囊(SHFs)細胞凋亡發生的分子機制。

研究樣本:生物學重複樣本-三隻羊,絨山羊毛發生長初期階段和中期階段(catagen vs. anagen)的皮膚,各三個重複。

研究技術: 經濟型模式-兩種文庫測序:

                  *去核糖體建庫測序方式-研究mRNA、lncRNA、環狀RNA;

                  *小片段建庫測序方法-研究miRNA;

研究結果:共鑒定到1122個已知和403個新lncRNA,其中173個lncRNA差異表達;另外鑒定到3500差異表達的Mrna表達轉錄本;411個已知miRNA和307個新miRNA,包含72個差異表達miRNA;進而對lncRNA的順勢和反試調控靶基因進行鑒定,發現,lncRNA和miRNA在毛囊發育過程之中具有重要的系統調控作用,比如生長中期誘導物因素(TGFβ1和BDNF)是由miRNA-873和lnc108635596 lncRNA-miRNA-Mrna調控網絡共同調控。

研究結論:闡明了在皮膚細胞凋亡和抗凋亡的分子相互作用,為毛囊退化提供深入的研究提供指導。    

                                                                           12864_2018_4603_Fig8_

                                                   圖2 LncRNA–miRNA–mRNA調控網絡圖

                    環形表示miRNA、方形表示編碼基因、三角形表示lncRNA. 紅色代表上調,綠色下調(初期/中期)


參考文獻:

[1]  Wang H, Zhao Y, Chen M and Cui J (2017) Identification of Novel Long Non-coding and Circular RNAs in Human Papillomavirus-Mediated Cervical Cancer.Front. Microbiol. 8:1720.

[2] Zhou G, Kang D, et al. Integrative analysis reveals ncRNA-mediated molecular regulatory network driving secondary hair follicle regression in cashmere goats. BMC Genomics. 2018 Mar 27;19(1):222.





圖片2

圖1 差異表達基因和差異表達miRNA靶基因韋恩圖

Target 表示差異miRNA的靶基因,mRNA表示差異mRNA對應的基因

圖片3

圖2 交集基因的表達量熱圖

圖片1

圖3 差異表達miRNA和差異靶基因的調控網絡分析靜态圖

圖片10

圖4 circRNA與來源基因關系網絡圖分析靜态圖

挑選差異表達circRNA與顯著差異表達來源基因關系網絡圖

圖中圓形表示環狀RNA,正方形表示差異表達的來源基因。 紅色表示上調,綠色表示下調

圖片4

圖5 ceRNARNA網絡圖

紅色表示候選的顯著ceRNA、綠色表示靶RNA,紫色表示第二層的ceRNA

圖片5

圖6 ceRNA—miRNA—mRNA調控網絡

紅色表示候選的ceRNA,藍色表示共享的miRNA,綠色表示靶RNA,灰色線條表示靶RNA與miRNA的關系,紅色線條表示候選ceRNA與miRNA的關系

圖片6

圖7 差異ceRNA—mRNA互作網絡圖

紅色表示差異顯著上調轉錄本,綠色表示差異顯著下調轉錄本,灰色表示差異不顯著的轉錄本。點越大表示點連接的關系越多

圖片7

圖8 差異ceRNA—miRNA—差異mRNA互作網絡圖

紅色表示上調,綠色表示下調,藍色表示miRNA;亮紅色和亮綠色表示上下調ceRNA,按暗紅色和暗綠色表示上下調靶RNAy。

紅色的線條表示邊的起始點是上調,藍色的線條表示邊的起始點是下調

圖片8

圖9 ceRNA—GO功能注釋網絡圖

深紅色表示GO功能,暗綠色表示下調ceRNA,暗紅色表示上調ceRNA

圖片9

圖10 ceRNA—KEGG功能注釋網絡圖

深紅色表示KEGG功能,暗綠色表示下調ceRNA,暗紅色表示上調ceRNA



樣本類型

總量

濃度

RIN

28S/18S

基線和5S

純度

Total RNA (Human / Rat)-廣譜性

≥400ng

≥20ng/μL

RIN≥7.0

 

 

 

 

28S/18S≥1.0

DNA,蛋白/鹽離子等污染,樣本無色透明不粘稠

 

 

Total RNA (Human / Rat)-大容量型

≥5.4ug

≥20ng/μL

RIN≥7.0

Total RNAPlant/Animal-廣譜型

2ug

≥40ng/μL

RIN≥6.5

Total RNAPlant/Animal-大容量型

7ug

≥40ng/μL

RIN≥7.0


Q1:全轉錄組産品兩種技術模式如何選擇?

全轉錄組有兩種模式,一種為經濟型,即采用兩種建庫測序模式;一種為大容量型,即采用三種建庫測序模式;主要區别在于環狀RNA研究方式不同,一個是對環狀RNA廣譜研究,即對環狀RNA表達情況初步研究; 二是對環狀RNA單獨富集建庫測序,即可實現對環狀RNA高深度研究,以及低表達環狀RNA的鑒定和定量分析等。所以如果選擇兩種模式,是需要根據研究目的和需求決定的,以及對RNA研究深度需求決定的。

Q2:全轉錄組送樣量要求?

需要根據選擇的研究模式決定,是滿足兩種建庫測序模式(LncRNA+Small RNA)總量需求:Total RNA最低起始量400ng ,還是滿足三種建庫測序模式(LncRNA+Small RNA+CircRNA)總量需求:Total RNA最低起始量5.4ug。

Q3:長鍊非編碼RNA建庫測序結果可以用于分析環狀RNA嗎?

可以,長鍊非編碼RNA建庫模式采用去核糖體方式建庫,對所獲得的RNA進行打斷測序,相當于獲得全部RNA,即可以進行分析環狀RNA表達情況,可應用于分析各物種環狀RNA表達譜。

Q4:LncRNA測序數據中mRNA的定量效果如何?

人标品:已知mRNA定量與qPCR定量斯皮爾曼系數達到0.88。


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