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單細胞全基因組甲基化測序

單細胞全基因組甲基化研究概述

       DNA的甲基化是在DNA甲基轉移酶的作用下将甲基選擇性地添加到胞嘧啶上形成 5-胞嘧啶的過程,剛被發現時被定義為第5種堿基,實際上它是一種非常關鍵的表觀遺傳學标簽,對于調控和維持不同細胞類型的轉錄程序起到極其重要的作用。

       同一個生物個體内幾乎所有不同類型的細胞都擁有幾乎完全相同序列的基因組DNA,相同序列的 DNA 分子可以有大量不同的甲基化修飾狀态,正是這些甲基化修飾狀态的不同,使得每種類型的細胞,甚至是每個細胞都有自己特定的基因表達特點。這些不同的修飾以及修飾的組合,使得不同種類的細胞,或者同種細胞類型不同細胞間産生異質性。這種單細胞水平的細胞類型特異的基因組甲基化修飾狀态,是表觀遺傳學領域的重要研究方向。


研究流程

圖1 單細胞全基因組甲基化測序産品策略圖


技術優勢

  • 首先對細胞進行BS處理,再加接頭擴增,最大限度減少單細胞内DNA甲基化修飾的損失。
  • 在随機引物擴增過程加接頭,減少操作步驟、降低DNA損耗。


信息分析内容

1.        去接頭污染、低質量的reads,并統計數據産出量及測序質量;

2.        将Clean Data中的reads比對到ref基因組,并統計比對率、duplication rate、Insert Size分布及平均測序深度;

3.        全基因組C位點的甲基化信息計算,并統計BS轉化率及C位點的深度-覆蓋度;

4.        CGI、promoter區域的C位點覆蓋度;

5.        甲基化水平的分布:

a)        多樣本時,各樣本全基因組上的整體平均甲基化率的分布;

b)        全基因組(n kb窗口)的甲基化水平的分布及圖形展示;

c)        各樣本中,幾類gene區域中,甲基化狀态分布的趨勢;

6.        甲基化/非甲基化 位點個數的統計,及它們在各gene元件上的個數分布;

7.        甲基化/非甲基化 區域的計算;

8.        CGI的甲基化狀态的展示:

a)        甲基化的、非甲基化的、中間甲基化狀态的CGI的個數分布;

b)        CGI平均甲基化率的分布;

9.        多樣本時,樣品聚類;

10.    多樣本時,同質性/異質性的分析;

a)        CpG位點甲基化狀态的一緻性計算;

b)        CGI區域甲基化狀态的一緻性計算;

c)        樣本間n kb窗口的甲基化水平的相關性;

11.    Group間DMR區域的計算及注釋。



單細胞全基因組甲基化測序揭示鼠肝甲基化組的強烈異質性

Single-cell genome-wide bisulfite sequencing uncovers extensive heterogeneity in the mouse liver methylome

研究概述:

通過對21個肝髒細胞和5個胚胎成纖維細胞進行全基因組甲基化測序,分析其全基因組5mC甲基化圖譜,結果發現鼠肝髒細胞甲基化可變性非常高,并具有高度的異質性;其中包含H3K4mel的區域可變性最高,promoters和CpG islands最為穩定。同時,文章發現不同基因組特點的5mC甲基化異質性也有所差異;其中非功能位點,如重複序列、内含子區域最不穩定;潛在的功能區位點,如:promoters區域最為穩定。

 結果展示:

1. 單細胞全基因組甲基化的genome-wide 5mC分析結果展示:

1

 

2. 5mC 異質性分析結果展示:

2

 



圖1

圖1 500bp窗口下的CpGs水平分析


圖7 所有樣本甲基化水平相關性分析

圖2 所有樣本甲基化水平相關性分析


圖11 樣本聚類分析

圖3 樣本聚類分析


圖12 甲基化CGIs重複性分析

圖4 甲基化CGIs重複性分析


圖15 gDMR組間甲基化差異程度分布

圖5 gDMR組間甲基化差異程度分布


圖16 DMR相關基因的GO聚類分析

圖6 DMR相關基因的GO聚類分析



樣品要求:

  • 裂解好的單細胞:細胞數目為實際數目的兩倍(如客戶計劃做5個細胞,應該至少送10個細胞);
  • 細胞培養物(細胞系、原代培養細胞等):完整且有活性的細胞數量不少2x105 個;
  • 新鮮組織:組織尺寸不小于1cm3 或者消化後細胞數目不少于1x107 個(BGI 僅提供通用組織消化方法,不同組織消化條件略有不同,需要自行測試)。
  • 血液:不少于5ml EDTA 抗凝血。


Q1:單細胞全基因組甲基化測序大緻流程如何?

單細胞分離(口吸管法)→單細胞裂解→Bisulfite轉化→Index建庫&PCR→文庫質檢→上機測序→信息分析→結果交付。

Q2:單細胞全基因組甲基化測序建議測多深的覆蓋度?

對單細胞樣品來說,建議測序深度4X-5X即可。實驗數據表明,單個細胞在clean data為3X數據量的情況下,其CpGs的覆蓋度為20%,并趨于飽和态。

 Q3:單細胞全基因組甲基化的技術穩定性及重複性如何?

測評數據表明,使用單細胞全基因組甲基化建庫方法進行建庫測序的多細胞(Bulk)樣品CpG位點一緻性可達79.52%,說明該方法的穩定性及重複性較好。

圖1

圖1 500bp窗口下的CpGs水平分析

Bulk為多細胞樣本,CpG位點的一緻性為:79.52%。其中包含了4個樣本:Bulk1(5ug),Bulk2(50ng),Bulk3(50pg),Bulk4(15pg)。

YHsc為單細胞樣本,單細胞文庫間的相關性較多細胞(Bulk)樣本差,分别為62.34%,說明單細胞間的異質性是比較明顯的。


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