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産品服務

Sequencing services

代謝全譜

       代謝組學(Metabonomics/Metabolomics)是繼基因組學和蛋白質組學之後新興發展起來的學科,其主要目标是定量地研究生命體對外界刺激、生理病理變化以及基因突變而産生的體内代謝物水平的多元動态反應,其研究對象是相對分子質量 1000 DA以内的小分子物質,如脂類、酮類、有機酸等。

       代謝全譜分析采用液相色譜-質譜聯用采集樣品的代謝物質譜圖,比較不同組樣品代謝産物的含量,尋找差異代謝物,并探索差異代謝物之間的代謝通路。可用于生物标志物的發現,中醫藥研究,疾病診斷等等。根據研究對象的不同,代謝全譜分析主要分為常規代謝組和脂質代謝組。常規代謝組的研究對象是機體内全部的代謝物,希望能夠盡可能全面地覆蓋到更多的代謝物種類,包括羟基酸、氨基酸、糖類、脂類、有機酸等;脂質代謝組的研究對象主要是脂類物質,包括脂肪酸、甘油糖脂、甘油磷脂、鞘脂、固醇脂類、苯酚脂類等。

産品優勢

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産品應用

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技術路線

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信息分析

1. 标準信息分析

1.1 數據預處理(濾噪、峰匹配、峰提取)及歸一化

1.2 數據質控

•  QC樣本TIC重疊圖

•  QC樣本PCA分析

1.3 統計分析

•  單變量分析(差異倍數及T檢驗)

•  多變量分析(PCA,PLS-DA)

1.4 差異離子篩選及鑒定(注意此處鑒定到的代謝物為質譜數據與開源數據庫匹配得到候選代謝物。最終确認代謝物還需要與标準品進行匹配,最終确認代謝物不包含在此分析内)

1.5 聚類分析

1.6 候選差異代謝物Pathway注釋

2. 個性化信息分析

2.1 ROC分析

2.2 代謝物相關性分析

2.3 代謝通路影響因素分析



1、代謝組學聯合宏基因組學對漢族人群肥胖機制進行研究

Gut microbiome and serum metabolome alterations in obesity and after weight-loss intervention. Nature medicine. 2017

背景:腸道微生物的組成和變化會受到許多因素的影響,比如年齡和飲食,然而還有一個平時可能被大家所忽略的因素就是種族。因此,這項以中國漢族年輕人為樣本的研究,對我國腸道微生物與肥胖研究領域來說有着十分重要的意義。本研究是上海交通大學瑞金醫院和華大基因共同完成的。研究人員以中國的漢族年輕人為研究對象,确定了一個能抑制肥胖的腸道微生物——多形拟杆菌,還研究了其對代謝産物氨基酸水平的影響。

技術路線:

圖3

主要結論:

1)肥胖志願者的拟杆菌屬細菌大量減少,是因為代謝産物芳香族氨基酸(AAA)以及支鍊氨基酸(BCAA)的增加;這兩類氨基酸在過去的研究中已經被證明與II型糖尿病的發生發展有關。

2)肥胖人群中谷氨酸的含量非常高,與苗條人群的差異也最大,而且在肥胖人群中,它的含量與多形拟杆菌的數量呈反比。

3)多形拟杆菌、谷氨酸含量與肥胖的關系進一步在小鼠模型和人體中進行了确認

圖4

圖1 協變量分析CIA和典範對應分析CCA

a實驗和對照組間217個MLGs和148個代謝物豐度變化協變量分析;b實驗組和對照組富集的217個MLGs和22個差異表達氨基酸進行典範對應分析CCA。

圖5

                            圖2 差異表達代謝物的聚類分析

                              對151個樣本中的148個差異表達代謝物進行聚類分析。

2、首個中國人群糖尿病相關非靶向血漿脂質組研究

Lipidomic profiling reveals distinct differences in plasma lipid composition in healthy, prediabetic and type 2 diabetic individuals. Giga Science. 2017

背景:華大與蘇州疾控中心合作,研究中國2型糖尿病患者、糖尿病前期與糖耐受正常人群的血漿脂質代謝物組成及差異,并為亞洲人群的脂代謝研究提供了參考。

研究内容:

樣品:114位二型糖尿病患者,81位早期糖尿病患者,98位血糖正常的人(NGT)

脂質組學:LC-MS/MS

數據分析:QI

技術路線:

圖1

主要發現:

1)随機森林分析篩選出28個疾病有關離子,對其和疾病表型進行相關性分析

2)lysophosphatidylcholine (lysoPC) 和 acylcarnitine可作為二型糖尿病早期診斷biomarker。

圖2

                        圖3 一般線性模式對選擇出的28個離子和表型進行相關性分析




1、鑒定和定量結果

本項目采用先進的質譜儀Xevo G2-XS QTOF (Waters,UK) 進行質譜數據采集,使用商業化軟件Progenesis QI(version 2.2)(Waters,UK)和自主研發的代謝組學R軟件包metaX[1]對質譜數據進行統計分析,其中代謝物鑒定基于數據庫KEGG。

        表1 總離子數和鑒定結果

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        表2 差異離子及鑒定結果

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2、質控分析

QC樣本在樣本檢測前用于平衡“色譜-質譜”系統,在樣本檢測過程中用于評價質譜系統的穩定性

圖1

圖1 QC樣本TIC重疊圖

TIC即總離子流圖,以時間點為橫坐标,以每個時間點質譜圖中所有離子的強度加和為縱坐标,連續描繪得到的圖譜。QC樣本為同一個樣本,它們TIC的重疊圖可以用于初步判斷儀器狀态,重疊程度越高說明儀器越穩定。

圖2

                  圖2 QC樣本主成分分析

和TIC重疊圖同理,質控樣本QC可以相對聚集在一起,聚集得越好表明儀器越穩定,采集的數據質量越好。X軸表示第一個主成分,Y軸表示第二個主成分。括号裡的數字表示該主成分能綜合原始信息的比例。

3、統計分析

1)單變量統計分析

該項目采用的是T檢驗和變異倍數分析(Fold change analysis,FC analysis)。在統計分析過程中,進一步對統計檢驗産生的p-value進行FDR校正得到q-value。最終結果以火山圖(Volcano plot)形式呈現差異倍數(Fold change)和q-value兩個指标,通常以差異倍數≥1.2 或≤0.8333,q-value值小于0.05作為篩選差異代謝物的條件。

圖3

圖3 火山圖

log2(fold change)為橫坐标,q-value的負對數-log10(q-value)為縱坐标。fold change小于等于0.8333或大于等于1.2且q-value值小于0.05的點标注為紅色,其餘點為藍色。

2)多變量統計分析

從海量數據中發現代謝組學潛在标志物,除了單變量分析還需借助多變量統計分析方法,常用的多變量分析方法有主成分分析(PCA)和偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)。

圖4

              圖4 主成分分析模型

橫坐标代表第一主成分PC1,縱坐标代表第二主成分PC2,圖中每個點代表一個樣品,不同顔色代表不同組别。括号裡的數字表示該主成分能綜合原始信息的比例。

圖5

               圖5 PLS-DA判别分析模型的得分圖

橫坐标代表第一主成分PC1,縱坐标代表第二主成分PC2。圖中每個點代表一個樣品,兩種顔色符号的離散程度分别代表了兩組樣本在PC1和PC2軸上的分布趨勢。

4、差異離子篩選及鑒定

該項目采用多變量分析PLS-DA模型前兩個主成分的VIP值,結合單變量分析差異倍數(fold-change)和q-value值來篩選差異表達的代謝物。篩選條件: 1)VIP ≥ 1 ;2) fold change ≥1.2 或者 ≤ 0.8333 ;3) q-value < 0.05,三者取交集,得到共有的離子即差異離子。

圖6

圖6 差異離子聚類分析

圖中的每一行代表一個差異離子,每一列代表一個樣本,不同顔色表示不同的強度,顔色從綠色到紅色,表示強度從低到高。


1. 代謝樣品

一般不推薦客戶送提取好的代謝物樣進行檢測,如果客戶确已提取好了,需送代謝物樣本進行預實驗檢測。

2. 代謝組織樣品

                                                                                            表1 代謝組織類樣品送樣要求

樣品類型

送樣量

備注

組織(動植物)

≥100mg

總重量最低不低于50mg

酵母、黴菌類真菌和細菌等微生物

≥10mg;菌液≥20µL;細胞個數≥107

必須經過淬滅(即将微生物迅速用液氮或者有機溶劑(-40℃)滅活,使其代謝瞬間停止)

生物體液(血漿、血清)

≥200 µL

總體積最低不低于100 µL;血漿為采用抗凝劑抗凝後, 除去血細胞的液體;血清為血液凝固後的上清液

生物體液(尿液)

≥1mL

總體積最低不低于200 µL;尿液需新鮮,未做任何處理

糞便

≥100mg

不能有糞便儲存液,直接-80℃凍存

*所有樣本均需在采集後,立即置入液氮中速凍,-80℃低溫冷凍保存,幹冰寄送;建議送樣量能滿足實驗的所有測試需求,最低送樣量有一定風險,具體是最終實驗結果為準。


Q1:代謝的三種平台GC-MS,LC-MS,NMR有什麼區别呢?

A1: LC-MS的覆蓋範圍很廣泛,可用于絕大部分化合物的檢測分析,樣品前處理步驟簡單。GC-MS主要用于易揮發、熱穩定、中低極性物質的檢測,比如含羟基、羧基、氨基和亞氨基等基團的極性強的物質,樣品前處理相對繁瑣,但譜圖庫較為健全;NMR重複性很好,對樣本制備要求少,快速,沒有偏好性,但靈敏度不及質譜技術。

Q2:代謝物鑒定搜索的數據庫有哪些?

A2:我們搜索的庫主要包括公共庫和自建庫,HMDB、KEGG、METLIN等等,精确度都在10ppm以内(一個分子量仍然會對應多個代謝物),如果庫裡面有相應的二級譜圖,那麼鑒定就可以更加的精确,後續如果要驗證的話,可購買标準品。

Q3:代謝全譜對于樣本數量有要求嗎?

A3:對于目标在于尋找差異代謝物的代謝全譜來說,臨床樣本數量每組建議不低于30個,推薦50個以上。模式生物及動植物樣本,建議不少于10個。樣本量少得到的結果個體差異可能會超越組間差異,使得結果中無法篩選出差異代謝物。


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