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目标蛋白定量分析

       目标蛋白定量分析産品是指利用基于質譜的多反應檢測技術(Multiple Reaction Monitoring, MRM)有目标地分析檢測可能與特殊功能相關的關鍵蛋白在多樣本中的表達量變化情況,進而推測這些蛋白的生物學功能的新型技術産品。

       MRM技術作為一種高特異性、高靈敏度的質譜數據獲取方式,在進行目标蛋白質組學的研究中發揮了重要作用,逐步受到更多的研究者們關注。該技術基于三重四級杆質譜儀,根據已知信息或假定信息設定檢測規則,記錄符合規則的離子信号,去除大量不符合規則的幹擾信号,快速、高效地對數十個目标蛋白進行定性、定量分析。

屏幕快照 2018-05-07 上午10

圖1 MRM工作原理

酶解後的肽段經過液相分離系統進入質譜儀進行檢測。第一重四級杆(Quadrupole,Q1)隻允許特定質荷比的肽段離子(parent ion,母離子)通過,第二重四級杆(Q2)誘導母離子碰撞得到肽段的碎片離子,第三重四級杆(Q3)隻允許特定質荷比的碎片離子(fragment ion,子離子)通過,并且記錄子離子信号。MRM技術通過母子離子對(transition)的選擇,去除幹擾離子,降低化學背景,提高物質定量靈敏度。

 

産品優勢

  • 通量高:一次上機檢測,可同時得到數十種目标蛋白的定量信息。
  • 周期短:無需抗體制備和Western Blotting實驗過程,極大縮短了項目周期。
  • 準确性高:通過對目标蛋白母子離子對的選擇,去除幹擾離子,靶向精确定量。
  • 特異性高:避免抗體制備過程中引入的非特異性結合因素,高效篩選目标蛋白。

 

産品應用

  • 大範圍蛋白質組檢測後的目标蛋白驗證。
  • 同源蛋白或突變蛋白定量研究。
  • 開發臨床診斷預測試劑盒。

 

技術路線

目标蛋白分析包括方法建立、目标蛋白檢測、生物信息學分析三個部分。

 圖2


信息分析内容

1、方法建立

1)目标蛋白總結

2)數據質控

3)MRM方法展示

 

2、樣本檢測

1)定量信息

2)數據歸一化

3)目标蛋白相對定量

 

3、定制化信息分析

可結合客戶的需求,協商确定定制化信息分析内容。


1、采用iTRAQ和MRM研究兩種藥物作用二型糖尿病分子機制

The serum protein responses to treatment with Xiaoke Pill and Glibenclamide in type 2 diabetes patients. Clinical Proteomics. 2017

背景:含有中藥成分和格列本脲的消渴丸與格列本脲相比,不僅能夠有效治療糖尿病,還能顯著降低低血糖症副作用的出現風險,但其作用機制尚不清楚。 

方法思路:

圖片 1

圖1方法思路

 

結果:

  • 在49個差異蛋白中選擇32個進行MRM驗證,68%的蛋白與iTRAQ結果一緻。
  • 兩種不同藥物處理共有差異蛋白的比例34%遠低于有無低血糖共有差異蛋白57%

 圖片 2

圖2 蛋白差異統計結果

兩種藥物處理後iTRAQ檢測共49個蛋白差異表達,17個蛋白為兩種藥物共有差異蛋白,28個為有無低血糖兩組共有差異蛋白。

 

主要結論:

1)兩種抗糖尿病藥物對于疾病的治療是通過不同蛋白起作用的

2)血清中不存在低血糖的biomarker

3)與抗糖尿病藥物相關的血清蛋白可能也參與了低血糖症狀

 

2、研究大豆不同品種對害蟲的耐受性

Proteomic analysis by iTRAQ-MRM of soybean resistance to Lamprosema Indicate. BMC Genomics.2017.

背景:豆卷葉野螟分布在中國各地,遼甯受害重。主要危害大豆、綠豆、菜豆、荨麻等作物。本課題将兩個品種大豆(抵抗品種- Gantai-2-2(HR)和敏感品種- Wan 82–178(HS))的栽培暴露在豆卷葉野螟環境中(0h和48h),對差異蛋白質組進行研究(iTRAQ+MRM)。

研究思路:

實驗:iTRAQ 8标,兩個品種(HR和HS),2個時間點(0h和48h),2個生物學重複;MRM驗證

主要發現:

0h和48h對比,HR和HS兩個品種分别鑒定到31個和53個差異蛋白,在0h HR/HS的差異蛋白數是28。大多數的差異蛋白與核糖體亞油酸代謝、激素信号轉導、黃酮的生物合成、抗性相關等代謝途徑有關。

圖片 5                                   圖片 6

圖3 每組差異蛋白做聚類圖                                                   圖4 MRM驗證

 

 


1、方法建立

1)目标蛋白總結

首先,利用高分辨質譜儀TripleTOF 5600 (SCIEX, Framingham, MA, USA)對樣品進行蛋白鑒定,通過Mascot軟件(Matrix Science,UK)結合使用相應物種蛋白數據庫對質譜數據進行搜索和蛋白質鑒定。對于本展示項目37個目标蛋白,29 個蛋白具有鑒定圖譜和唯一肽段。然後,利用QTRAP 5500質譜儀(SCIEX, Framingham, MA, USA)對這些肽段進行 MRM 方法驗證。最終,建立了28 個蛋白質的 MRM 方法。

表1  目标蛋白信息總結(部分)

屏幕快照 2018-05-09 下午3

 

2)數據質控

建立一個目标蛋白的 MRM 質譜方法,需要有标準品指示目标蛋白在質譜檢測的準确性。利用真實樣品的目标蛋白質譜鑒定數據,可真實記錄目标蛋白的出峰時間和鑒定證據。從目标蛋白中,挑選具有二級圖譜信息支持的肽段,并确保該肽段對于目标蛋白是唯一肽段。利用Skyline軟件,我們針對唯一肽段設置 MRM 方法,并使用QTRAP 5500質譜儀對 MRM 方法進行驗證。

圖1       圖2

圖3              圖4

圖1 MRM方法建立過程肽段數據示意圖

左上,肽段鑒定譜圖,展示唯一肽段的二級圖譜信息;右上,肽段的碎片離子 MRM色譜圖;左下,肽段碎片離子強度信息;右下,肽段預測保留時間與實際保留時間相關性。

 

3)MRM方法展示

本項目對28 個目标蛋白成功建立了 MRM 質譜方法。表2展示了每個蛋白每對 transition 的詳細信息。

表2 目标蛋白MRM方法詳細信息(部分)

屏幕快照 2018-05-09 下午3

 

2、樣本檢測

1)數據歸一化

本項目利用外參蛋白β-galactosidase 的方法進行數據歸一化,以降低MRM非标定量的實驗誤差。一般情況下,所有 transition 的信号都會用于目标蛋白的定量,但是如果發現個别 transition 由于背景幹擾導緻強度跟其他 transition 不一緻,這些 transition 會去除。目标蛋白的每個 transition 的信号會通過β-galactosidase 的信号進行歸一化。

 圖5          圖6

圖2 數據歸一化過程

左圖,目标蛋白每個肽段的色譜出峰時間誤差,RT≤±2min;右圖,目标蛋白所有transition歸一化強度分布。

 

2)目标蛋白相對定量

在提取目标蛋白所有歸一化強度後,本項目利用一個線性混合模型進行目标蛋白在樣品中的相對定量,此模型整合在MSstats工具包中,該統計分析會給出蛋白在比較組的比值以及校正p值(ajusted p-value)。校正p值也反映原始統計檢驗的假陽性(Benjamini and Hochberg方法),目标蛋白在1.5倍差異且校正p值<0.05(假陽性<0.05)的條件下認為是差異蛋白。

圖7           圖8

圖3 目标蛋白相對定量

左圖,目标蛋白所有肽段質定量信息變異系數分布,一般認為80%的肽段CV<20%為數據質量好;右圖,目标蛋白在所有比較組的相對定量分布,橫坐标為比值取log2,縱坐标為校正p值取-log10,目标蛋白在1.5倍差異且校正p值<0.05的條件下認為是差異蛋白。


1、組織類樣品送樣要求

表1 組織類樣品送樣要求

樣品類型

送樣量

備注

動物組織

≥100mg

植物葉片≥0.5g;富含雜質或蛋白質含量低的樣品量幹重≥1g,如植物的根、木質部、韌皮部組織等

植物、蕈類真菌(如蘑菇、木耳)、藻類

≥1g

酵母、黴菌類真菌和細菌、噬菌體等微生物

≥200mg(菌體約20μL)

新鮮培養細胞數(個)

≥3~5×106(細胞沉澱體積

約30uL~50µL左右)

血液類

血清、血漿≥500µL;全血 ≥5mL

解凍後血細胞會破裂,蛋白溶出來會影響分析,因此一般不建議送全血

2、蛋白類樣品送樣要求

表2 蛋白類樣品送樣要求

蛋白

≥500μg,濃度≥1µg/µL


Q1:隻知道蛋白序列,MRM技術能否像Western blot技術一樣精确的找到該蛋白并對它的量進行分析?

A1:有目标蛋白的序列信息,MRM是可以替代Western lot技術進行目标蛋白的精确定量,定性和差異分析。

 

Q2:MRM技術進行質譜時,可以一次監測多少個蛋白?是隻能對一個特定蛋白監測,還是多個特定蛋白同時監測?

A2:主要根據蛋白豐度和樣本基質的情況決定,不同樣本不同蛋白的理化性質不一樣,一般情況下,MRM可同時檢測200對transition,預計是20-40個蛋白質。

 

Q3:如果不知道蛋白質的信息,能否進行MRM?若隻有基因組的信息,能否進行?

A3:進行MRM必須明确知道目标蛋白質,并獲得蛋白質的全序列;如果有基因組信息,一般都會有預測編碼蛋白序列,可以先翻譯成氨基酸序列再進行MRM。

 

Q4:母子離子對是怎樣選擇的?一個子離子是否會對應多個母離子,怎樣保證特殊性?是否一定要有相關數據庫的支持?

A4:母子離子對是通過LC-MS/MS産生的譜圖庫篩選,軟件設定,并經過實驗優化獲得的;一個子離子可能對應多個母離子,可以通過MRM的全譜掃描分析出子離子唯一對應的母離子。最好要有相關的數據庫支持,若沒有,可以自行篩選,但是工作量可能較大。

 

Q5:什麼時候進行母子離子對的設定?如何設定?

A5:母子離子對需要在樣品進入質譜儀之前設定并調試好。先通過譜圖庫篩選到得到母子離子對,設定參數,進行質譜鑒定,若出現的譜圖顯示捕捉到目的肽段,那就可以适用,若不行,重新設定,這樣不斷的反複驗證篩選獲得最适的母子離子對。

 

Q6:MRM在做蛋白質定量方面有哪些優勢?

A6:優異的定向性:去除背景噪音,定向研究目的蛋白;高通量:能實現大規模樣本的定量分析;特異性好:無非特異性交叉反應;

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