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産品服務

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蛋白 DIA 定量分析

       蛋白定量DIA産品,主要采用數據非依賴性采集模式(data independent acquisition,DIA),通過液質聯用技術(LC-MS/MS)對蛋白質酶解肽段進行質譜分析,結合傳統的數據依賴性采集模式(data dependent acquisition,DDA)構建的譜圖庫,利用業内頂尖的商業化DIA分析軟件Spectronaut,可對蛋白質組進行鑒定、定量,獲得肽段、蛋白及所屬物種來源、蛋白表達量變化等信息。

 産品優勢

蛋白定量DIA技術,采用全景式數據采集模式,效果對比下:

DIA vs DDA

圖1 HRM(DIA)vs Shotgun proteomics(DDA)

圖中橫坐标是分組的樣本編号,縱坐标是蛋白質種類,該圖展示的是各樣本中,不同質譜采集模式下,蛋白質峰強度情況。其中DIA比DDA的峰強度覆蓋度更好,偏向性較小;DDA缺失值較多,并且對高豐度肽段有偏向性。

  • 鑒定數高:鑒定數提高30%;一針組織樣本鑒定數可達7000+
  • 重複性好:技術重複性提高30%,可達90%
  • 定量準确性好:通過二級譜峰面積定量,大項目質控CV低至25%
  • 質控完善:加入iRT校正;QC樣本重複性CV<30%的比例大于67%
  • 周期短:實際樣本上機不分組,提高結果重複性的同時,壓縮周期3倍以上
  • 費用低:降低費用3倍以上

 

産品應用

圖片 2


技術路線

DIA技術路線


 信息分析内容

信息分析條款

信息分析内容

标準信息分析

譜圖庫構建

1.1 數據産出統計

1.2 譜圖庫鑒定結果

标準信息分析内容

2.1 數據産出統計

2.2 數據質控(組内變異系數、主成分分析以及樣本定量相關性)

2.3 蛋白質鑒定和定量結果

2.4 蛋白質GO分析

2.5 蛋白質COG/KOG分析

2.6 蛋白質Pathway代謝通路分析

2.7 差異蛋白的GO富集分析

2.8 差異蛋白COG/KOG富集分析

2.9 差異蛋白的Pathway富集分析

2.10 重複性分析(僅針對設計了重複的實驗)

2.11多樣品間表達模式聚類(三個或三個以上樣品可提供)

2.12 時間序列分析

2.13 差異表達蛋白互作分析

2.14 差異表達蛋白亞細胞定位

定制化信息分析

蛋白質組與轉錄組/RNA-seq表達量關聯分析

3.1 表達量關聯分析:

3.1.1 從鑒定、定量、差異三個層面進行關聯統計

3.1.2 對定量層面關聯結果細分為如下五類,并分别對其做GO/COG/Pathway注釋分析:

         蛋白和mRNA表達趨勢相同;
         蛋白和mRNA表達趨勢相反;
         蛋白無變化,mRNA差異表達;
         mRNA無變化,蛋白差異表達;
         蛋白和mRNA均無變化。

3.1.3 蛋白組與轉錄組聚類分析

3.2 功能富集關聯分析

3.2.1 GO富集關聯分析

3.2.2 Pathway富集關聯分析

3.3 轉錄組和蛋白組的Pathway整合圖


1、11家實驗室SWATH*技術平行性評測

Multi-laboratory assessment of reproducibility, qualitative and quantitative performance of SWATH-mass spectrometry. Nature communications. 2017.

*注:SWATH技術與DIA技術原理相同,同為二級譜采集荷質比範圍内全部母離子的碎片離子信息,但不同儀器公司開發此技術時使用的名稱有别,故可以理解為同一種技術。

背景:實驗結果可重複是科學研究最基礎的原則。本文評估了全球11家實驗室共同鑒定和定量到的蛋白數據集,其重現性、線性動态範圍和靈敏度都非常接近于SRM——蛋白定量金标準。這份數據支持SWATH聯合肽段标準打分的分析方法,适合于大範圍實驗室間全面、重現性好的蛋白組研究。

方法思路

圖1

圖1 實驗設計

30個穩定同位素标記肽段(SIS)分成5組(group A-E),每組6種肽段,每組樣本中肽段的稀釋濃度從1fmol到10pmol(綠色标記S5),然後将每組肽段稀釋4次後混入HEK293樣本中(S1-4),獲得一系列稀釋濃度從0.012到10000fmol。将樣本分成相同的11份分發給全球範圍内的11個實驗室,評估1天、1周内不同地點的數據采集情況。

 

主要結論:

1)蛋白鑒定情況

在全球11個實驗室采集的229份SWATH-MS數據中,過濾條件為蛋白水平FDR 1%,共檢測到4984種蛋白,4077種蛋白在超過80%的樣本中被檢測到。

圖2

圖2  蛋白鑒定的數目和一緻性

每種顔色代表一個實驗室的所有數據,11個實驗室所有數據集的重複性中位數是91.6%(蛋白水平)和79.5%(肽段水平)

 2)定量重現性

經過肽段水平的中位數均一化後,利用4077種在超過80%樣本中檢測到的蛋白去計算同一天内、不同天内、不同實驗室數據采集之間的變異系數,分别是8.3 ± 16.2%, 11.9 ± 17.2%, and 22.0 ± 17.4%。

 圖3

圖3

圖3 變異系數

比較單個實驗室一天内、不同天内的CV變化,以及不同實驗室間的CV變化

 3)線性和動态範圍

利用樣本中加入的同位素标準肽段,在每個實驗室計算梯度濃度設置的标準肽定量結果線性拟合系數,平均決定系數(R2)是0.97。去除高濃度肽段信号飽和的點,決定系數增加到0.99。在樣本之間設置的标準肽理論倍數有9和27,實際檢測到的差異倍數是7.49和19.6,主要原因也是高濃度的标準肽已經導緻質譜儀信号檢測飽和。

 圖4 圖4

圖4 平均峰面積和蛋白水平動态範圍統計

平均峰面積圖各點連接顯示出各實驗室間良好的線性指标(圖左),蛋白水平動态範圍是4.5個數量級範圍(圖右)

 展望:

  • 目前SWATH-MS蛋白定量技術沒有選擇最優肽段定量蛋白,是未來優化技術的一個方向。
  • 本研究證明了SWATH-MS适用大規模樣本蛋白組學水平的定量,為後續的藥物靶點研究、精準醫療提供了必要工具。
  • 大規模樣本量的蛋白組學定量,可以與基因組學水平的關聯分析,比如基于蛋白表達水平的數量遺傳性狀研究、基于蛋白表達水平的全基因組關聯分析和藥物篩選。

2、蛋白定量DIA用于慢性疼痛的研究

Standardized Profiling of The Membrane-Enriched Proteome of Mouse Dorsal Root Ganglia (DRG) Provides Novel Insights Into Chronic Pain. Molecular & Cellular Proteomics. 2016.

背景:慢性疼痛是一種治療方案有限的複雜疾病。雖對其發病機理進行了多次研究,但各結果間存在較大不一緻性,主要受限于傳統蛋白質組shotgun技術固有的缺陷。發病機制依然不清晰。

實驗設計

  • 炎症性疼痛和神經性疼痛兩種模型鼠及其對應control鼠共4組,各3個生物學重複
  • 每個生物學重複由10-13隻鼠pooling而成
  • 解剖獲得同側背根神經節膜部分提取蛋白進行DIA蛋白定量

圖5

圖 5 實驗設計類型

CFA慢性炎症性疼痛模型、Veh為其對照;SNI慢性神經性疼痛模型、Sham為其對照

主要發現

1)DDA建庫鑒定到3067個蛋白,迄今鑒定數最多的背根神經節蛋白研究。

2)DIA四組都鑒定到的蛋白有2526個,其中CFA和Vehicle都鑒定到的有2581個;SNI和Sham都鑒定到的2600個,表明實驗重複性較好。

3)炎症性和神經性疼痛差異蛋白分别為64和77,兩種模式共有差異蛋白為12個。

4)其中Serca蛋白在兩種模式小鼠中表達量變化相反,表明兩種疼痛的調控機制不同。

5)western blot和免疫組化對上述DIA結果進行了驗證。

圖6

圖6 四組實驗模型的蛋白聚類分析


1、蛋白鑒定和定量概況

表1 各樣本鑒定結果概覽

Name

Peptide number

Protein number

N_1

73592

7123

N_2

83437

7720

……

……

……

表2 差異蛋白統計列表

Comparsion group

Down-regulated

Non-regulated

Up-regulated

T-VS-N

381

8005

703

XR-VS-N

242

8369

479

XR-VS-T

137

9020

118


圖1  圖1

圖1 差異蛋白統計圖

以Fold change≥2和Q-Value<0.05兩個條件作為顯著性差異蛋白的篩選标準,得到組間上下調蛋白統計(左圖)及火山圖(右圖)

 

2、質控

 圖2     圖2

圖2 CV分布及主成分分析

根據組内變異系數(CV,左圖)評估實驗的穩定性和重複性;通過主成分分析(PCA,右圖),将同一實驗組不同樣本間聚合成簇。

 

3、功能分析

 圖3     圖3

圖3 多樣本關聯分析結果展示

左圖,樣本相關性分析熱圖;右圖,時間序列分析

 圖4

圖4 顯著富集的pathway統計圖

圖中x軸富集因子為注釋到該Pathway的差異蛋白數除以注釋到該Pathway的所有鑒定到的蛋白


表1 組織類樣品送樣要求

樣品類型

送樣量

備注

新鮮動物組織幹重

≥50mg

富含雜質或蛋白質含量低的樣品量幹重≥5g,如植物的根、木質部、韌皮部組織等

植物和蕈類真菌(如蘑菇、木耳)類

樣品量濕重

≥1g

酵母、黴菌類真菌和細菌、噬菌體等微生物

200mg

新鮮培養細胞數()

≥3~5×106(細胞沉澱體積

30ul~50µl左右)

血液類

血清、血漿≥500µl;全血 ≥5ml

解凍後血細胞會破裂,蛋白溶出來會影響分析,因此一般不建議送全血

表2 蛋白類樣品送樣要求

樣本類型

送樣量

蛋白液

≥200μg,濃度≥1µg/µl


Q1:怎樣選擇标記定量或非标記定量?

标記定量一般用于比較背景相似的樣本間的蛋白組差異,若同組比較的樣本數≤8,推薦選擇iTRAQ标記技術;若同組比較的樣本數>8且≤10,推薦選擇IBT标記技術。非标記定量技術的限制情況相對較少,無論樣本間背景是否相似,若同組比較樣本數>10,都可推薦選擇非标記蛋白定量DIA;若希望蛋白鑒定數越多越好,或需要鑒定單個樣本中的特有蛋白,樣本數<10,也可推薦使用DIA。

綜上,以下情況可優先選擇iTRAQ:

1、定量樣本數低于8個(即同時比較的樣本數≤8)

2、樣本背景極為相似(相同物種和相同的樣本類型)

3、經費有限,需要通過高性價比方案完成研究

4、實現更好的重複樣本間的定量重複性

更适合選擇蛋白DIA定量分析的情況:

1、實驗樣本數高于10組

2、不同物種、不同來源或部位的樣本,需要同時進行蛋白組分析和定量

4、追求更精準的定性定量效果,避免标記和液相分組引入的實驗誤差

5、需要對采集的數據進行多次分析

介于9-10個樣本的項目,推薦華大IBT 10-plex定量産品。

 Q2:蛋白定量DIA和傳統的非标記定量有何優勢?

傳統的非标記定量一般需要通過分級的方法開展,耗時久、重複性差、數據結果可信度不高;蛋白定量DIA技術是新一代非标記定量技術,可通過更優的數據采集模式,在相同時間采集到更豐富的信息,壓縮周期的同時,大福度提高樣本間平行比較的重複性,數據結果可信度極高。


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