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  • 首頁蛋白 iTRAQ /IBT 定量分析

蛋白 iTRAQ /IBT 定量分析

       定量蛋白質組學(Quantitative Proteomics)是對一個基因組表達的全部蛋白質或一個複雜混合體系内所有蛋白質進行精确鑒定和定量。可用于篩選和尋找任何因素引起的樣本之間的差異表達蛋白,結合生物信息學揭示細胞生理病理功能,同時也可對某些關鍵蛋白進行定性和定量分析。 

       iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)技術是由AB SCIEX公司研發的一種體外同重同位素标記的相對與絕對定量技術。蛋白定量iTRAQ技術利用多種同位素試劑标記蛋白多肽N末端或賴氨酸側鍊基團,經高精度質譜儀串聯分析,可同時比較多達8種樣品之間的蛋白組表達量差異,是近年來定量蛋白質組學常用的高通量篩選技術。iTRAQ标簽簡圖以及定量方法見下圖:

圖1


圖1 iTRAQ試劑結構

iTRAQ試劑結構包括三個部分:報告基團、平衡基團、肽反應基團,其中同位素标簽部分是指前兩部分。

圖2

圖2 蛋白定量iTRAQ原理示意圖

蛋白定量iTRAQ技術,樣本酶解後的肽段進行iTRAQ标記後混合上機,通過二級質譜采集到報告基團的信号強度,判斷不同樣本間的蛋白豐富變化。

        IBT蛋白定量分析,作為常規iTRAQ蛋白定量分析的升級版,是華大基因首推的蛋白定量領域十标新産品。它基于華大基因與合作夥伴共同開發的IBT标記技術,通過深入優化實驗步驟和信息分析流程,将原本iTRAQ技術的标記上限8個樣本/批次,增加至10個樣本/批次甚至更多,結合高分辨率質譜儀高效快速的掃描效率,全面解決多于8個比較組的蛋白樣本定量問題。IBT蛋白定量分析産品能夠提供優于常規iTRAQ技術的鑒定、定量結果,為廣大客戶提供一種性價比更高的蛋白組定量分析新選擇。

圖3

圖3 IBT試劑結構

IBT(isobaric tags)試劑結構與iTRAQ類似:IBT由報告基團、平衡基團組成,分别有10标和6标兩種試劑,可滿足不用實驗設計需求,其中小于7個樣品的設計選取相差1Da的标簽,大于7個樣品選取相差0.006Da的标簽。

 

表1 三種同重同位素标簽報告基團彙總

Tag

iTRAQ

TMT

IBT

Mode

4-plex

8-plex

6-plex

10-plex

10plex (6-plex)

Reporter 1

114

113

126

126

114

Reporter 2

115

114

127

127N

115N

Reporter 3

116

115

128

127C

115C

Reporter 4

117

116

129

128N

116N

Reporter 5

 

117

130

128C

116C

Reporter 6

 

118

131

129N

117N

Reporter 7

 

119

 

129C

117C

Reporter 8

 

121

 

130N

118N

Reporter 9

 

 

 

130C

118C

Reporter 10

 

 

 

131

119

從功能上看,蛋白定量IBT類似于Thermo公司出品的同重同位素标簽TMT,提供6-plex和10-plex兩種标記試劑,供不同樣本個數的項目選擇合适的試劑。


産品優勢

  • 高通量:可同時對10種以内實驗樣本進行蛋白組定量分析和比較。
  • 周期短:标記混合上樣大幅度壓縮機時, 縮短項目周期。
  • 高重複性:采用多個标記樣本同時上機的方法,避免樣本分别上機檢測和傳統制膠實驗重複性差的問題。
  • 質控嚴格:MALDI結合LC-MS對酶解、标記步驟進行嚴格質控;IQuant軟件對下機數據進行嚴格質控。
  • 一站式解決方案解決驗證問題:蛋白定量iTRAQ/IBT結合MRM靶向蛋白定量方法, 提供從發現到驗證一站式的解決方案,基于類似的液質聯用平台開展實驗,避免技術方法帶來的結果差異。
  • 多組學方案聯合深入挖掘數據:從基因組、轉錄組,到蛋白組、代謝組,完善的貫穿組學研究方法實現對數據結果的深入挖掘。

 

産品應用

人類疾病研究

  • 疾病生物标志物篩選和驗證
  • 疾病發生發展過程中的蛋白表達調控機制
  • 藥效評估

 動植物基礎研究

  • 重要農作物農藝性及其改良措施
  • 動植物生長發育機制研究
  • 抗逆抗病機制研究

 

技術路線

  流程圖

 

信息分析

信息分析條款

信息分析内容

标準信息分析

1 标準信息分析内容

1.1 數據産出統計

1.2 蛋白質鑒定結果

1.3 蛋白質定量結果

1.4 蛋白質GO分析

1.5 蛋白質COG/KOG分析

1.6 蛋白質Pathway代謝通路分析

1.7 差異蛋白的GO富集分析

1.8 差異蛋白的COG/KOG分析

1.9 差異蛋白的Pathway富集分析

1.10 重複性分析(僅針對設計了重複的實驗)

1.11多樣品間表達模式聚類(三個或三個以上樣品可提供)

1.12 差異表達蛋白互作分析

1.13 差異表達蛋白亞細胞定位

定制化信息分析

變異與新轉錄本檢測

2.1 在蛋白層面對SNP/SNV進行鑒定與定量

2.2 在蛋白層面對InDel進行鑒定與定量

2.3 在蛋白層面對可變剪切進行鑒定與定量(此項僅适用于轉錄本resequencing

2.4 在蛋白層面對新轉錄本進行鑒定與定量

适用的物種及數據庫版本有限制,目前适用的物種有Hsapies ()Mmusculus(小鼠)Rnorvegicus(褐家鼠) ,其他物種及具體适用的數據庫版本請咨詢後台。

蛋白質組與轉錄組/RNA-seq表達量關聯分析

3.1 表達量關聯分析:

3.1.1 從鑒定、定量、差異三個層面進行關聯統計

3.1.2 對定量層面關聯結果細分為如下五類,并分别對其做GO/COG/Pathway注釋分析

         蛋白和mRNA表達趨勢相同;

         蛋白和mRNA表達趨勢相反;

         蛋白無變化,mRNA差異表達;

         mRNA無變化,蛋白差異表達;

         蛋白和mRNA均無變化。

3.1.3 蛋白組與轉錄組聚類分析

3.2 功能富集關聯分析

3.2.1 GO富集關聯分析

3.2.2  Pathway富集關聯分析

3.3 轉錄組和蛋白組的Pathway整合圖


1、多組學技術研究結腸癌藥物抗性與癌細胞非整倍體間的關系

Drug-resistance in Colorectal Cancer Cell Lines is Partially Associated with Aneuploidy Status in Light of Profiling Gene Expression. J. Proteome Res. 2016

背景:HCT116和LoVo是結直腸癌研究中常用的兩種細胞系,其中HCT116是二倍體細胞,LoVo是多倍體細胞。SN38和QxPt是目前臨床上治療結直腸癌最常用的兩種藥物,但其抗藥性經常影響臨床效果,目前的研究對于抗藥性的形成并沒有解釋。我們試圖從基因表達水平,通過iTRAQ技術結合IBAQ分析,研究多倍體情況是否影響HCT116和LoVo兩種細胞系的SN38或OxPt抗藥性的形成。

 方法思路:

研究藥物抗性,首先要了解藥物誘導細胞内抗性反應的分子機制。很多癌細胞會産生非整倍體,需要确定是否非整倍體情況導緻了藥物抗性。外顯子測序反映細胞的非整倍體狀态,RNAseq和液質聯用法檢測mRNA和蛋白水平的基因表達情況。

  • 選擇HCT116-SN38, HCT116-OxPt, LoVo-SN38,LoVo-OxPt為研究用細胞系;
  • 利用WES,mRNA,iTRAQ等技術進行基因表達水平及蛋白水平的染色體倍型分析。

 主要結論:

1)對HCT116, HCT116-OxPt, and HCT116-SN38而言,染色體倍型沒有發生變化,說明染色體情況并沒有影響HCT116細胞抗藥性。

2)對LoVo, LoVo-OxPt, and LoVo-SN38, 多倍體在LoVo-SN38LoVof非抗藥性細胞之間發生了變化,有一個三倍體出現在LoVo-SN38細胞中,這可能是SN-38抗藥性形成的因素之一。

圖1

圖1 RNASeq和iTRAQ實驗均證明兩種細胞系單個染色體的基因表達情況與染色體狀态一緻

Lovo的5、7、12、15染色體表達高于HCT116。耐藥菌株通過10個月不斷提高藥物濃度篩選出來。Lovo耐藥株在SN38作用下,發生了14号染色體基因copy增加的情況;說明sn38影響了癌細胞的整倍體狀态,與耐藥性部分相關。

2、借助iTRAQ技術研究大豆胚根的蛋白功能

Combined transcriptomic and proteomic analysis constructs a new model for light-induced anthocyanin biosynthesis in eggplant (Solanum melongena L.). Plant Cell Environ. 2017.

背景:固有無序蛋白(IDPs)在所有生命體的重要生理過程中起到多種重要的作用,然而植物面臨環境壓力時和固有無序蛋白的表達量關系目前沒有全面的報到。本文目的主要是通過對大豆胚根進行分析,研究壓力相關蛋白,為了發現固有無序蛋白的功能,選擇未萌發的胚根0mm和萌發出15mm長的胚根進行實驗,綜合分析抗壓能力和蛋白功能。

實驗設計:

  • 植物的處理:0mm、15mm大豆胚根;3次生物重複
  • 提取蛋白和iTRAQ标記:iTRAQ 8-plex
  • RT-PCR 和 Western-blotting
  • 圓二色性分析
  • LDH酶活測定
  • 固有無序蛋白的E-value

主要發現:

1)固有無序蛋白在生物體中發揮重要作用,iTRAQ定量的795個熱穩定蛋白含有高比例的無序蛋白(15%),整體蛋白組的無序蛋白(9%)。熱穩定蛋白包含IDPs可以在複蘇過程中保護乳糖脫氫酶。

2)比較R0mm 和 R15mm 的大豆胚根中的795個熱穩定蛋白,分别有170個和89個蛋白豐度改變,說明在種子生長過程中有很多蛋白發生了改變。

圖2

圖2 R0mm vs. R15mm火山圖

從差異倍數和顯著性篩選差異蛋白,圖中标紅的點即為符合條件的差異蛋白

 圖3


圖3 基因表達水平進行半定量RT-PCR和western blot

A 随機選取14個蛋白豐度R0mm提高的基因和3個豐度不變的進行RT-PCR ;B 挑選3個基因進行western blot。

3)KEGG分析表明,18個蛋白參與半胱氨酸和蛋氨酸代謝,9個蛋白參與類苯基丙酮代謝通路。

4)各類研究結果綜合表明,對壓力細胞中酶和蛋白的保護是固有無序蛋白的生物功能。


1、  标準信息分析

1.1 蛋白鑒定結果

在某個蛋白質ITRAQ定量測試項目中,共有 8 組 Human 樣品,分别為: A、B、C、D、E、F、G、H,共進行了2次重複實驗,共有152673 張二級譜圖生成下機。在"1%譜圖水平FDR"過濾标準下,一共有26860 條肽段被鑒定到,而在"1%蛋白水平FDR"過濾标準下,一共有4065 個蛋白被鑒定到。下表展示各個樣品的鑒定情況。

表1 各個樣本蛋白的鑒定情況

表1

1.2 蛋白定量結果

 ITRAQ定量由華大開發軟件IQuant來實現。在本項目中, B/AC/AC/BE/DF/DF/E 被設置為比較組。單次實驗的顯著差異蛋白以Fold change>=1.5 Q-value < 0.05 兩個條件篩選。

 圖1

圖1 差異蛋白柱狀圖


圖2

圖2 差異蛋白火山圖

1.3 蛋白GO、COG、Pathway注釋分析,差異蛋白的GO、Pathway富集分析

GOCOGPathway注釋分析及富集分析均是基于不同的系統,對檢測到的蛋白或是有顯著差異的蛋白進行劃分。下圖展示了差異蛋白顯著富集的Pathway代謝通路,圖中X軸富集因子(RichFactor)為注釋到該Pathway的差異蛋白數目除以注釋到該Pathway的所有鑒定到蛋白,該值越大,說明注釋到該Pathway差異蛋白比例越大。圖中圓點大小代表注釋到該Pathway的差異蛋白的數目。

圖3

圖3 顯著差異的pathway統計圖

1.4 重複性分析

該項目利用 CV 值來評估定量的重複性。 CV=标準差SD/平均meanCV 值越低,重複性越好。下圖展示重複實驗的CV分布,X軸為CV分布範圍,10%0~10%範圍,20%10%~20%範圍。Y軸為相應CV範圍的蛋白數目。圖右側為各CV範圍蛋白的累計比例。

圖4

圖4 重複實驗的CV分布圖

1.5 多樣本間表達模式聚類

聚類分析(Cluster analysis)作為一種有效的數據分析工具,已廣泛地應用于圖像處理、信息檢索、數據挖掘等領域。聚類分析在基因或蛋白表達數據的分析中同樣有廣泛的應用,主要包括:通過對基因或蛋白聚類發現未知基因或蛋白的功能:對樣本聚類自動地對病理特征或實驗條件進行分類,通過兩路聚類找出在某些條件下參與調控的基因或蛋白簇等。

這裡我們用Euclidean距離和系統聚類方法(Hierarchical Cluster)來對差異蛋白聚類。

../Documents/2018Q1工作/蛋白定量新升級/iTRAQ/Submit/BGI_result/Cluster/cluster2/pheatmap/pre-S-VS-pre-C-pre-R-VS-pre-C.inter.png

 圖5

 

 

圖5 差異蛋白的表達聚類圖

1.6  差異表達蛋白互作分析

蛋白之間通常通過相互作用結合成複合物之後行使相應的功能。通過與STRING蛋白互作數據庫比對,對差異表達蛋白進行互作分析,并且取可信度前100的互作關系繪制了網絡互作圖。

圖6

圖6 差異蛋白互作關系網絡

1.7 差異表達蛋白亞細胞定位

蛋白質在核糖體中合成後經蛋白質分選信号引導後被轉運到特定的細胞器中,部分蛋白質則被分泌到細胞外或留在細胞質中,隻有轉運到正确的部位才能參與細胞的各種生命活動。蛋白質的亞細胞定位是蛋白功能注釋的重要部分。

圖7

圖7 差異蛋白亞細胞定位

 

2、  蛋白質組與轉錄組/RNA-seq表達量關聯分析

對轉錄組與蛋白組中每個比對組所有關聯上的mRNA和蛋白質的表達量相關性進行分析,如下圖,展示了差異顯著的mRNA和蛋白表達量一緻的基因:

圖8

圖8 橫坐标為蛋白質的表達量,縱坐标為基因的表達量

表達量關聯分析的關鍵在于分析基因表達産物上下遊的調控關系,通過整合轉錄組與蛋白組在同一條代謝通路上的表達量情況,可以很直觀地展示基因的調控作用。

 圖9

圖9 網頁版的形式展示,可用鼠标點擊Pathway圖中的各個基因,相應的蛋白和mRNA的表達量信息會出現在左上角

3、  變異與新轉錄本檢測(需要轉錄組重測序/外顯子/重測序數據(三選一))

轉錄組/外顯子/重測序的數據能夠提供樣本中變異和新轉錄本的信息,通過對蛋白質組的研究,可以進一步确認在基因組、轉錄組水平上發生的突變和新轉錄本,是否在蛋白質組水平有表達,如下圖:

圖10

圖10 三種變異類型和新轉錄本鑒定到的肽段數目


1、組織類樣品送樣要求

表1 組織類樣品送樣要求

樣品類型

送樣量

備注

新鮮動物組織幹重

≥200mg

富含雜質或蛋白質含量低的樣品量幹重≥5g,如植物的根、木質部、韌皮部組織等

植物和蕈類真菌(如蘑菇、木耳)類

樣品量濕重

≥1g

酵母、黴菌類真菌和細菌、噬菌體等微生物

200mg

新鮮培養細胞數(個)

≥3~5×106(細胞沉澱體積

約30ul~50µl左右)

血液類

血清、血漿≥500µl;全血 ≥5ml

解凍後血細胞會破裂,蛋白溶出來會影響分析,因此一般不建議送全血

2、蛋白類樣品送樣要求

表2 蛋白類樣品送樣要求

樣本類型

送樣量

蛋白液

≥200μg濃度≥1µg/µl


Q1:怎樣選擇标記定量或非标記定量?

A1:标記定量一般用于比較背景相似的樣本間的蛋白組差異,若同組比較的樣本數≤8,推薦選擇iTRAQ标記技術;若同組比較的樣本數>8且≤10,推薦選擇IBT标記技術。非标記定量技術的限制情況相對較少,無論樣本間背景是否相似,若同組比較樣本數>10,都可推薦選擇非标記蛋白定量DIA;若希望蛋白鑒定數越多越好,或需要鑒定單個樣本中的特有蛋白,樣本數<10,也可推薦使用DIA。

 

Q2: iTRAQ怎樣設置重複?

A2:推薦至少進行2次及以上生物學重複,否則iTARQ實驗結果一般不能被雜志接收。

 

Q3:不同試驗的樣本做iTRAQ定量可否放在一組上機?

A3:不能。因為不同試驗的研究對象一般有差異,即便是同樣的物種,處理方式也會有不同,這種情況下,不同來源的樣本混在一起上機,會大大提高樣本中蛋白種類的複雜程度,影響質譜的分辨能力,降低蛋白鑒定數目和定量效果。所以不同來源的樣本,蛋白表達差異過大者,必須分别上機進行檢測。

 

Q4:為什麼有些差異表達基因在蛋白層面沒有相應的差異蛋白?

A4:從生物學角度看,由于RNA調控、蛋白降解、蛋白分泌、轉錄和翻譯效率不一緻等原因,導緻蛋白水平和轉錄水平未必呈現一樣的趨勢,這是正常現象。

 

Q5:隻通過蛋白定量iTRAQ技術找到的差異蛋白,可否直接認定為biomarkers?

A5:從生物實驗的角度來講,通過一種實驗得到的結果是需要再進行驗證的。在發現階段,用蛋白定量iTRAQ技術找到的差異蛋白,一般還需要通過其他技術進行驗證後,再得出最終的結論,推薦采用目标蛋白定量MRM技術,或者傳統的western blotting(Western Blot)技術進行驗證。


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