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産品服務

Sequencing services

  • 首頁蛋白鑒定分析

蛋白鑒定分析

      蛋白鑒定分析,利用質譜技術對細胞、組織、體液或經過分離、純化、富集後的蛋白膠/液等類型樣本中全部或特定的蛋白進行種類鑒定,充分了解特定環境下蛋白質種類情況是進行蛋白質組學研究的基礎,為研究疾病發生發展過程以及動植物生長發育狀态提供直觀的蛋白質種類鑒定結果。蛋白質鑒定分析類産品按研究對象和内容的不同,可分為以下三個産品:蛋白全譜分析,膠點/膠條鑒定和蛋白質分子量測定。

蛋白全譜分析

      蛋白全譜分析是對蛋白質組的整體分析方法,通過質譜手段能得到盡可能多的蛋白質信息。主要用于對未知樣品中含有的蛋白質種類進行全面的分析。基于質譜技術的蛋白全譜分析,可以為蛋白質高通量的定量和修飾分析提供參考信息。此外,結合全譜分析數據和轉錄組數據,可以相互補充并共同驗證基因注釋及功能信息。

膠點分析

      雙向電泳得到蛋白質圖譜,用相關軟件分析得到差異或感興趣的蛋白質點,使用質譜技術對其進行鑒定,得到蛋白質的詳細信息。

膠條/蛋白液分析

      SDS-PAGE膠中分離出的指定條帶或較少組分(一百以内)蛋白液進行質譜鑒定。

圖片1

圖1 膠點(左)膠條(右)圖

蛋白分子量測定

      通過質譜技術得到較為準确的蛋白質分子量。可對單一組分或多組分蛋白質分子量進行檢測,檢測範圍在1-1000 KD。

産品優勢

  • 儀器精準:基于高分辨率(大于105)、高質量精度(小于1ppm)質譜平台,确保鑒定結果準确性。
  • 高鑒定性:系統全面地研究組織或細胞中盡可能多的蛋白質,可鑒定多達6000種蛋白。
  • 适用範圍廣:無物種特異性限制,理論上可用于所有物種。

産品應用

2

技術路線

3

注:藍色箭頭表示全譜分析;綠色箭頭表示膠點/膠條分析;灰色箭頭表示蛋白分子量鑒定

信息分析内容

信息分析條款

信息分析内容

标準信息分析

1.1    數據産出統計

1.2    蛋白質鑒定結果

1.3 分子量測定結果(僅适用于蛋白質分子量測定)

1.4 蛋白質GO分析(僅适用于全譜分析和膠條鑒定)

1.5 蛋白質COG分析(僅适用于全譜分析和膠條鑒定)

1.6 蛋白質Pathway代謝通路分析(僅适用于全譜分析和膠條鑒定)

個性化信息分析

2.1 單個樣本蛋白質相對豐度定量(iBAQ)(僅适用于全譜分析和膠條鑒定)

定制化信息分析

3.1 可結合客戶需求,協商确定定制化信息分析服務内容。

 


1、睾丸組織蛋白全譜

Tissue-Based Proteogenomics Reveals that Human Testis Endows Plentiful Missing Proteins. J. Proteome Res. 2015

研究背景:睾丸組織具有較高的基因表達水平,利用質譜技術得到睾丸樣本的蛋白全譜信息,對缺失蛋白(Missing Proteins,MPs)進行研究,得到有潛力的biomarker。

實驗思路:

  • 采用glycine-SDS-PAGE和tricine-SDS-PAGE兩種分離方法,對三個睾丸樣本進行分離;
  •  通過LC-MS/MS對樣品進行全譜分析,得到總蛋白鑒定結果。

全譜分析

圖1 睾丸蛋白質組全譜分析流程圖

主要結果:共鑒定9597個蛋白,此次鑒定是迄今為止睾丸組織鑒定數最高的質譜數據。

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圖2 睾丸樣品的分離和鑒定結果

(A)三個睾丸樣本的glycine-SDS-PAGE和tricine-SDS-PAGE;(B)glycine-SDS-PAGE和tricine-SDS-PAGE分離後鑒定的蛋白數量。

2、通過蛋白質組學方法研究印度梨孢菌和油菜的共生互作分子生理機制

Proteomic approach to understand the molecular physiology of symbiotic interaction between Piriformospora indica and Brassica napus. Sci Reprots.2018.

研究背景:許多研究都集中在具良好前景的植物内生真菌上,以保護植物免受營養缺乏和環境脅迫,從而獲取更好的發展和生産力;此外,蛋白質數量及質量在很大程度上受基因組、轉錄組和轉錄後修飾水平調節。因此,通過蛋白質組學工具開展物種間的互作關系具有極其重要的意義。

實驗思路:

  •  首先使用MS培養基培養油菜四周并收集其根部;
  • 進行蛋白提取并使用LC/MS對蛋白質進行定量及鑒定;
  • 通過信息分析将蛋白提交至數據庫比對,獲取蛋白互作關系及差異表達蛋白。

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圖3 印度梨孢菌和油菜的共生互作實驗示意圖

主要結果:鑒定出8123個蛋白,其中在高置信水平條件下(p-value ≤ 0.05, fold change ≥2, confidence level 95%)發現有34個蛋白明顯下調,12個明顯上調;将所鑒定出的差異蛋白進行圖譜繪制,發現大量涉及到代謝過程、共生信号、應激/防禦反應、能量産生、養分獲取、生物合成的基本代謝産物的基因集群。

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圖4 GO富集對油菜根部的差異表達蛋白的富集分析

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圖5 參與能量代謝和蛋白質調控的差異表達蛋白質間相互作用網絡

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圖6 印度梨孢菌和油菜籽植物共生體中與主要代謝蛋白網絡相關聯的差異表達蛋白(DEPs)的示意圖

在蛋白質組學水平上顯著檢測到的DEPs使用綠色彩雲狀突出标記。


1. 标準信息分析

1.1 蛋白鑒定結果

          蛋白鑒定結果表包含每個樣品鑒定到的蛋白具體信息,包括蛋白分組号、蛋白ID号、相對分子質量、等電點、描述信息、鑒定覆蓋率、鑒定肽段數、鑒定譜圖數以及匹配相同肽段的蛋白質ID。

表1 鑒定蛋白列表

Sample

Total_spectra

Identified_spectra

Identified_peptides

Identified_proteins

Jurkat

88053

43657

16708

5129

1.2 蛋白質GO分析

Jurkat

圖1 蛋白質的GO功能注釋

GO分類圖顯示了三個本體中所涉及到各條目的分布情況,不同顔色标記為三個本體中涉及到的各個條目

1.3 蛋白質COG分析

Jurkat

圖2 COG注釋結果統計

縱坐标為COG分類條目,橫坐标為功能分類對應的蛋白數量。該圖表示樣品中不同功能的蛋白質的統計數量

1.4 蛋白質Pathway代謝通路分析

map04144

圖3 KEGG數據庫中Endocytosis pathway的詳細代謝通路圖

紅框表示本項目中鑒定到的蛋白

1.5 蛋白分子量測定

單一質譜

圖4 單一組分蛋白樣品質譜圖

橫坐标m/z:荷質比,縱坐标Intens:峰度

質譜峰基本信息如下:

M/z

Intens

3108.076

1.5*105

1550.199

8000

多組分質譜

圖5 多組分蛋白樣品質譜圖

橫坐标m/z:荷質比,縱坐标Intens:峰度

質譜峰基本信息如下:

M/z

Intens

1752.867

6.0*105

1892.986

5.8*105

1956.902

4.3*105

2033.064

3.0*105

1612.746

1.8*105




1. 蛋白樣品送樣要求

表1 蛋白樣品送樣要求

樣品類型

服務類型     

蛋白

肽段

膠點、膠條

備注

蛋白全譜分析

≥500 µg,濃度≥1 µg/µL

消化前蛋白含量≥50 µg

___

 

蛋白膠條鑒定分析

(包含單一蛋白鑒定)

≥30 µg,濃度≥1 µg/µL

≥50 fmol/µL,體積≥10 µL

考染或銀染

肉眼可見

銀染膠不能含戊二醛;且保證在電泳後一周内進行切膠送樣;寄送時在管子裡加水,防止膠幹燥;-4℃保存,幹冰寄送

蛋白膠點鑒定分析

≥50 pmol

≥50 fmol/µL,體積≥10 µL

膠點直徑≥1.0 mm;

考染或銀染肉眼可見

 

蛋白分子量測定

≥5 µg,蛋白純度應>90%,濃度≥1 µg/µL

___

___

 

2. 組織列樣品送樣要求

表2 組織類樣品送樣要求

樣品類型

送樣量

備注

動物組織

≥100 mg

植物葉片≥0.5 g;富含雜質或蛋白質含量低的樣品量幹重≥1g,如植物的根、木質部、韌皮部組織等

植物、蕈類真菌(如蘑菇、木耳)、藻類

≥1 g

酵母、黴菌類真菌和細菌、噬菌體等微生物

≥200 mg(菌體約20 µL)

新鮮培養細胞數(個)

≥3~5×106(細胞沉澱體積

約30~50 µL

如需進行修飾位點富集鑒定,則需細胞數達到107(約細胞沉澱體積100 µL左右)

血液類

血清、血漿≥500 µL;

全血 ≥5 mL

解凍後血細胞會破裂,蛋白溶出來會影響分析,因此一般不建議送全血;如直接送提取好的蛋白,請去除高豐度,并附上去除高豐度前後的膠圖

唾液、羊水

5 mL

低于5mL需要做預實驗

尿液

≥50 mL

送樣品前用1000 g離心5 min,棄去沉澱

腦脊液

≥2 mL

腦脊液如果做多肽組定量不需要去除高豐度蛋白,僅需500 uL

*發酵液樣本請盡量多送。如果樣品材料具有特殊性請備注說明,如具有很厚的莢膜、容易氧化等。如樣本需要進行富集和蛋白修飾分析,應加大送樣量(動物組織、體液為3倍送樣量,植物組織為6倍送樣量),具體要求請與華大基因銷售代表聯系。




Q1:蛋白全譜分析鑒定數能達到多少?

A1:蛋白全譜分析鑒定到的蛋白數,與物種、樣本中蛋白質含量及複雜程度、實驗中蛋白組分分離程度、數據庫的完整度都有很大的關系。如植物來源的樣本中蛋白質種類通常比動物來源的樣本多,動物組織樣本中蛋白質種類通常比其血液樣本多。一般情況下,一次全譜分析可以鑒定到1000-3000種蛋白。

 

Q2:雙向凝膠電泳與質譜聯用鑒定蛋白質的過程是什麼?

A2:通過對蛋白質雙向電泳的圖譜掃描,進行譜圖差異分析,找到差異點。把差異點切出,進行脫色、酶解、質譜檢測,得到質譜原始數據文件,通過數據庫搜索可以得到差異點中的蛋白質的詳細信息。

 

Q3:若跑完的膠采用的是銀染染色的方法,請問銀染試劑哪些會對後續的質譜鑒定産生影響?

A3:銀染試劑裡不要使用戊二醛,因為它會對蛋白進行修飾,這樣會對後續蛋白的鑒定結果産生影響。





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