logo

logo

産品服務

Sequencing services

  • 首頁環狀 RNA 測序

環狀 RNA 測序

         環狀RNA(circRNA)是一類特殊的非編碼RNA分子,與傳統的線性RNA(linear RNA)不同,circRNA分子合呈封閉環狀結構,且不受RNA外切酶影響,表達更穩定,不易降解。華大推出環狀RNA高通量測序服務,可進行環狀RNA的鑒定以及環狀RNA與miRNA‘’海綿效應‘’分析, 可實現ceRNA(competing endogenous RNAs,内源競争RNA)機制等研究。可應用在物種環狀RNA表達譜構建,環狀RNA疾病生物标記開發,環狀RNA作用機制研究等方面。

技術優勢

圖7

信息分析内容

一、标準信息分析

      1. 基本數據統計

        1.1去除接頭序列、低質量序列得到clean data

        1.2與核糖體數據庫比對,去除核糖體RNA數據

      2. 環狀RNA預測鑒定

      3. 環狀RNA所在線性基因注釋

      4. 環狀RNA在基因組上的定位

      5. 環狀RNA表達定量分析

      6. 樣品(組)間表達差異分析

二、高級信息分析

      1. 差異環狀RNA來源的基因GO功能及富集分析

      2. 差異環狀RNA來源的基因Pathway功能及富集分析

      3. 環狀RNA與miRNA互作分析(适用于人/小鼠物種)




CircRNA表達譜構建——通過高通量測序方法鑒定大豆環狀RNA表達

Genome-wide identification and characterization of circular RNAs by high throughput sequencing in soybean. Scientific Reports. 2017;7:5636. 

合作單位:中科院油料所,BGI 

案例描述

        大豆是古老的四倍體物種,大部分基因是多個拷貝的同源基因。盡管其他物種的環狀RNA已經鑒定,但是在大豆中的環狀RNA表達情況未知,尤其是同源基因來源的環狀RNA表達情況,所以本次研究采用高通量測序手段,結合RNase R酶處理方法和生信分析的手段揭示大豆環狀RNA表達。本次研究共鑒定到5372種環狀RNA,大約80%的同源環狀RNA來自同源基因,但仍呈現不同的表達模式,2134個環狀RNA被預測為92個miRNA靶向物,環狀RNA和環狀RNA的轉錄本表達模式呈現組織特異性,基于環狀RNA轉錄來源的基因功能主要集中在發育、代謝,以及組織特異性。

部分研究結果展示

1.     對大豆根、莖、葉的cricRNA及類型鑒定發現,總計鑒定5372個環狀RNA。

表1  大豆根、莖。葉circRNA鑒定及類型統計表

1

2.     大豆鑒定的環狀RNA來源的基因,經分析發現:80%的基因轉錄形成1種環狀RNA轉錄本(圖2a);另外大豆多拷貝的同源基因可形成不同的環狀RNA,即為同源環狀RNA。例如:三個同源基因(Glyma05g30210, Glyma08g13370,Glyma08g20100和 Glyma12g29120)轉錄生成同源環狀RNA,來源不同外顯子區域,所以命名不同 (圖 2b).

2

圖2a  環狀RNA轉錄來源的基因和同源環狀RNA統計:(a)環狀RNA來源的基因轉錄形成不同轉錄本類型統計;(b)舉例說明同源環狀RNA3. 預測到2,134 (39.7%)個 circRNAs 預測到92個miRNA結合位點, 共計5648個相互關系(見圖3a)。其中繪制57個差異顯著表達環狀RNA及其靶向miRNA互作網路關系(見圖3b).

3

圖3  大豆環狀RNA與miRNA互作關系網絡研究

 

CircRNA biomarker鑒定——來自ANXA2基因轉錄的環狀RNA可作為神經性多發性硬化症診斷的biomarker

Circular RNA profiling reveals that circular RNAs from ANXA2 can be used as new biomarkers for multiple sclerosis[J]. Human Molecular Genetics, 2017

發表單位:西班牙Biodonostia健康研究中心等

研究摘要

        為尋找多發性硬化症(MS)患病診斷的biomarker,本次采用患病組和對照組各選4個血液白細胞樣本進行研究,在406個差異表達環狀RNA中找到2個目标環狀RNA:circ_0005402和circ_0035560,在20個患病RR-MS個體中和18個正常人中進行驗證,使用The Wilcoxon test證實這兩個環狀RNA在患病中顯著低表達。并通過ROC 生存曲線分析:circ_0005402、circ_0035560 敏感性和特異性較高,可作為潛在的臨床患病診斷的biomarker。

部分研究結果展示

1、共發現406個差異表達環狀RNA,其中324低表達,82高表達;通過qPCR驗證10個差異表達環狀RNA, 其中5個高表達,5個低表達,其中驗證率為90%。

4

圖1  多發性硬化症環狀RNA差異分析,a:差異環狀RNA火山圖分析;b:差異環狀RNA聚類圖分析;c:qPCR驗證結果

2、通過ROC生存分析,結果顯示來自ANXA1-mRNA, circ_0003452_2 和circ_0005402具有較高敏感度,可作為潛在診斷的biomarker。

5

圖2  ANXA1-mRNA, circ_0003452_2 and circ_0005402 ROC生存曲線分析


圖1  circRNA數目在基因組上的分布圖

外圈表示染色體,内圈表示以1,000,000個堿基為滑動窗口時,circRNA數目在染色體上的變化。

圖2  circRNA表達量箱線圖

X軸為樣品名稱,Y軸為log10(RPB),每個區域的箱線圖對應五個統計量(自上而下分别為最大值、上四分位數、中值、下四分位數和最小值)。

圖3  差異circRNA的Volcano-plot分布圖

X軸代表log2轉換後的差異倍數值,Y軸代表-log10轉換後的顯著性值。紅色代表上調的circRNA,藍色代表下調的circRNA,灰色代表非差異的circRNA。

圖4  差異circRNA的Scatter-plot分布圖

X、Y軸均代表circRNA表達量的對數值。紅色代表上調的circRNA,藍色代表下調的circRNA,灰色代表非差異的circRNA。

圖5  差異circRNA的表達量熱圖

X軸代表聚類分析的樣品,Y軸代表差異circRNA。顔色代表log10轉換後的表達量(顔色越深表示表達量越高,越淺表示表達量越低)。

圖6  差異circRNA來源基因的GO功能分類圖

X軸代表差異表達circRNA來源基因的數目,Y軸代表GO功能分類。

圖7  差異circRNA來源基因的Pathway分類圖

X軸代表基因所占的比例,Y軸代表KEGG功能分類。将基因根據參與的KEGG代謝通路分為7個分支:細胞過程(Cellular Processes)、環境信息處理(Environmental Information Processing)、遺傳信息處理(Genetic Information Processing)、人類疾病(Human Diseasea)(僅限動物)、代謝(Metabolism)、有機系統(Organismal Systems)、藥物開發(Drug Development)。

圖8  差異circRNA來源基因的Pathway富集結果圖

X軸代表富集因子值,Y軸代表通路名稱。顔色代表q-value(顔色越白值越大,越藍值越小),值越小代表富集結果越顯著。點的大小代表差異circRNA來源基因的數目(點越大代表數目越大,越小代表數目越少)。Rich Factor指的是富集因子值,是注釋上某一通路的前景值(差異circRNA來源基因的個數)與注釋上某一通路的背景值(所有circRNA來源基因的個數)之商,數據越大,說明富集結果越明顯。


表1  CircRNA組織樣品送樣建議

組織類型

具體要求

新鮮培養細胞(細胞數)

≥1×106 cell

新鮮動物組織幹重

≥50 mg

新鮮植物組織幹重

≥200 mg

全血(哺乳動物)

≥2.5 mL淋巴細胞

≥2.5 mL Paxgene Blood RNA tube / RNAprotect® Animal Blood Tubes收集的全血

表2  CircRNA測序樣品判定标準

樣本類型

總量

濃度

RIN

28S/18S

基線和 5S

純度

Total RNA
(Plant)

≥5 μg

≥40 ng/μL

RIN≥6.5

28S/18S≥1.0

基線平整,5S 峰正常

DNA,蛋白/鹽離子等污染,樣本無色透明不粘稠

Total RNA
(
Animal
)

≥5 μg

≥40 ng/μL

RIN≥7.0

28S/18S≥1.0


Q1:Total RNA最低送樣量是多少?

5 ug/單次,詳細可見上面的送樣建議。

Q2:環狀RNA 推薦數據量?

根據飽和度分析,一般推薦10 G以上數據。

Q3:circRNA需要做生物學重複嗎?

需要。至少3個,實際越多越好。

Q4:lncRNA數據分析和環狀RNA标準建庫流程(R酶富集方法)分析的結果有什麼區别?

LncRNA數據(10 G clean data)鑒定到1千到2千個環狀RNA,數量級在千位;而富集方法可鑒定到2萬-3萬個環狀RNA,數據量級在萬位;兩種方式可根據客戶研究目的和需求進行針對性推薦,如客戶初期研究,可進行lncRNA建庫測序方法,具有較高性價比;如果是針對性的研究環狀RNA,可推薦環狀RNA标準建庫方法。

Q5:環狀RNA驗證方法?

定量驗證:根據junction位點設計引物進行qPCR驗證;

功能驗證:使用circRIP方法驗證miRNA Sponge功能;使用miRNA敲除及拮抗等模拟物進行功能驗證。

Q6:環狀RNA(circRNA)是不是很穩定、不存在降解?

CircRNA即為成環的RNA分子,其特性即是不易被RNase R降解。但是,實際上,降解分兩種,一種是RNase R的降解,一種是水解。水解是不區分環狀或者非環狀的過程,并且事實上環狀更容易被水解,因為環狀的堿基基團靠的近,羟基更容易去攻擊磷酸羟基鍵。将circRNA放在室溫或者60℃或者在鎂離子作用下,它們依然較容易被水解。在使用RNase R降解的過程中,體系中含有鎂離子(Mg2+),因此實際的操作過程可能存在對circRNA的水解。所以,RNase R降解法獲得circRNA的這種操作,可以提高檢測的敏感性,但是不能提高特異性。

Q7:如何預測circRNA?

因為在circRNA純化收集的過程中,需要去除核糖體RNA和線性RNA,然後打斷成片段進行建庫測序。在得到測序結果後,我們需要對circRNA進行預測鑒定。由于circRNA頭尾相接易環化,如果測序結果能獲得接頭序列(Jumping Sequence),便認為是circRNA。

Q8:CircRNA适宜用芯片技術還是測序技術?

建議使用測序技術,有利于新結果的發現和鑒定。

Q9:樣本間鑒定circRNA的差異大嗎?

大。樣本均一化操作在circRNA中是錯誤的,因為circRNA不屬于上面所提到的“絕大部分基因”(這部分基因在均一化時我們認為幾乎沒有變化),因此它的含量存在較大變化。


深圳華大科技(總部)

電話:400-706-6615
郵箱:info@genomics.cn