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産品服務

Sequencing services

RNA-Seq

        RNA-Seq,對某一物種或特定細胞在某一功能狀态下産生的mRNA進行高通量測序,可以提供定量分析,檢測基因表達水平差異。


技術優勢

數字化信号:測序直接獲得序列,無背景噪音,無交叉雜交;可鑒别序列間單個堿基的差異;

高通量:一次測序得到千萬條以上的序列;

檢測阈值寬:跨越6個數量級的寬檢測阈值,從幾個到數十萬個拷貝精确計數;

良好的重複性:深度測序保證了抽樣随機性,重複性非常好,無需重複實驗;

高靈活性 :依據客戶需求,提供不同測序平台服務。

 

産品應用

醫學上的應用方向——

 

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農學上的應用方向 ——

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研究内容

标準信息分析:

1)測序數據過濾;

2)參考基因組比對;

3)基因表達量分析;

4)基因表達量聚類分析;

5)時間序列分析(3個或3組及以上樣品);

6)差異表達基因檢測;

7)差異表達基因維恩分析;

8)差異表達基因層次聚類分析;

9)差異表達基因GO功能分析和網絡圖;

10)差異表達基因Pathway功能分析和網絡圖;

11)差異表達基因轉錄因子編碼能力預測和網絡圖(植物、動物樣品);

12)差異表達基因蛋白互作分析;

13)差異表達基因中的真菌緻病基因預測(真菌樣品);

14)差異表達基因中的植物抗病基因預測(植物樣品)

高級信息分析:

1)基因共表達網絡分析(15個及以上樣品,不包含在标準執行周期内)

定制化信息分析:

1. 可結合客戶的需求,協商确定定制化信息分析内容。


醫學案例:BGISEQ-500 RNA-Seq抗乙肝病毒免疫機制研究

案例描述:

        全球有乙肝病毒(HBV)感染而導緻的乙肝患者超過3.5億,其中約1/3在中國。除了接種疫苗,目前廣泛使用抗病毒天然免疫細胞因子IFNα(I型幹擾素)治療,但效率低,其分子機制尚不清楚。

       本研究通過高通量小RNA幹擾篩選、特異性敲除基因的小鼠模型、BGISEQ-500 RNA-Seq等技術手段,揭示了甲基轉移酶SETD2分子直接催化信号蛋白STAT1甲基化修飾在IFN的抗病毒免疫中起關鍵作用的新機制,為病毒感染性疾病的治療提供了新靶點。

研究結果:

1、SETD2經SET域促進STAT1活化,從而提高幹擾素誘導的抗病毒功能:

       HepG2細胞中敲除SETD2,産生出3個SETD2-KO細胞系,呈現出SETD2表達缺失和總的H3K36me3水平下降(圖F),與對照HepG2相比,都表現出幹擾素誘導的STAT1磷酸化作用受損(圖G)。觀察幹擾素處理的SETD2-KO HepG2細胞,IFNAR1/R2或 STAT1上遊信号分子的表達沒有顯著差異。通過RNA-Seq分析,發現一系列ISGs響應幹擾素刺激,在SETD2-KO細胞比HepG2 WT細胞表達更低(圖H)。qRT-PCR分析确定幹擾素刺激後在SETD2-KO細胞中兩個ISG表達降低,包括ISG15 和MX2(圖I)。所以,在幹擾素刺激下,SETD2提高STAT1磷酸化作用和ISG表達。

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圖1 SETD2促進幹擾素誘導的STAT1 磷酸化和 ISGs 表達

2、SETD2選擇性促進H3K36me3修飾的ISGs表達

       利用RNA-Seq,在SETD2-KO細胞、STAT1-K525A-Re細胞、STAT1-KO細胞以及對照的HepG2 細胞在幹擾素刺激下6小時(圖2A)。幹擾素刺激後對照HepG2細胞中222個基因被誘導,SETD2-KO 細胞、STAT1-K525A-Re細胞和STAT1-KO 細胞,與對照HepG2細胞相比,分别有89、128和180個基因顯著性下調(圖2B)。GO富集分析顯示SETD2-KO 細胞和 STAT1-K525A-Re細胞中表達更低的基因被歸類于病毒的防禦反應或I型幹擾素通路相關基因(圖2C)。STAT1-KO細胞在幹擾素刺激下下調的180個基因,其中有40%的基因在SETD2-KO細胞在幹擾素刺激下也表達更低,包括SETD2促進一系列的STAT1依賴的ISG(圖2D)。另外,在幹擾素刺激後的SETD2-KO 細胞和STAT1-K525A-Re細胞中,75個基因表達更低,包括有抗病毒功能的ISGs,比如ISG15、ISG20、MX2等(圖2D和2E)。進一步确定了SETD2介導的ISGs調控是在很大程度上依賴于在介導STAT1 K525單甲基化作用中它起到的作用。

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圖2 SETD2選擇性催化一些ISGs的 H3K36me3 修飾

參考文獻

Chen K, Liu J, Liu S, et al. Methyltransferase SETD2-Mediated Methylation of STAT1 Is Critical for Interferon Antiviral Activity. Cell. 2017 Jul 27;170(3):492-506.e14.

 

農學案例:BGISEQ RNA-Seq作物高效利用氮肥調控機制研究

案例描述:通過選育半矮化作物,極大地提高了綠色革命品種谷物的産量,但因使用過多無機氮肥而導緻環境惡化日益加劇。為加強全球糧食安全及可持續發展,提高作物氮利用效率的需求日益迫切。因此,亟需深入了解作物生長,氮同化、碳固定的共同調節機制。

研究方法:以NJ6 (SD1)為對照,對36個含有sd1的籼稻品種分析NH4+的利用率。再以NJ6為輪回親本與一個高NH4+吸收率品系NM73雜交創建BC1F2群體,通過QTL定位、圖位克隆等技術獲得氮肥高效利用的關鍵基因。分析關鍵基因啟動子的三種SNP分型,篩選不同型别影響作物産量的潛在聯系。

研究結果:

1、GRF4-DELLA相互平衡作用調節植物的生長和代謝。GRF4是生長調節因子,調節促進植物氮代謝和穩态,也協調促進植物碳代謝和生長,而DELLA生長阻遏物抑制這些過程。

2、半矮化作物中,在适度的氮素水平下增加GRF4的表達,GRF4-DELLA平衡機制偏向于GRF4的促進作用,從而利于氮、碳的吸收,增加葉、莖的寬度,但對高度影響很小。因此,GRF4表達增加改善氮素吸收效率的同時,不影響半矮化性狀,能進一步提高作物産量。

結果展示:

通過基于BGISEQ平台的RNA-Seq和ChIP-seq兩項技術,解析GRF4作用的分子機制,證明GRF4是激活下遊參與氮素吸收和氮素同化的相關基因。ChIP-Seq揭示了潛在的GRF4靶識别位點,其中主要是多個氮代謝基因啟動子共有的GGCGGC-motif。

GRF4與GIF1(GRF-interacting factor 1)複合體結合包含GCGG-motif的啟動子,促進氮素同化吸收。SLR1(屬于DELLA家族)在該途徑中可抑制GRF4與GIF1的相互作用,導緻氮素利用率降低。同時,GRF4還可以促進碳同化吸收相關基因的表達。

 

圖

圖3 GRF4調控多種氮代謝基因的表達

參考文獻

Li S, Tian Y, Wu K, et al. Modulating plant growth-metabolism coordination for sustainable agriculture. Nature. 2018 Aug;560(7720):595-600.



                                               圖3第一個圖HBRR-VS-UHRR圖3第二個圖HBRR2-VS-UHRR2_PossionDis_Method_network

      圖3第三圖 第二排第一個HBRR2-VS-UHRR2圖3第四個圖 第二排第二個HBRR1-VS-UHRR1圖3第五個圖 第二排第三個Coexpression

圖1 GO、KEGG、蛋白互作網絡、轉錄因子和WGCNA的基因共表達等五大特色關系網絡圖

                            圖4 第一個圖 第一排左圖4 第二個圖 第一排右blue

                           圖4 第三個圖 第二排左Modules_gene_black圖4 最後一個圖 第二排右

圖2 共表達基因模塊與樣品的相關性總覽圖,單個模塊的基因共表達網絡圖、GO和KEGG功能注釋


表1 BGISEQ-500 RNA-Seq樣品判定标準

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Q1:RNA-Seq是否需要做生物學重複?如果需要,一般要多少個重複樣本?

是的,2011 年 7 月 Hansen[1]發表的文章表明生物學差異是基因自身表達的特性,與檢測技術的選擇以及數據處理的方式無關。生物學重複實驗,可以在很大程度上消除樣本的個體差異、系統平台差異,能更準确地檢測差異基因。如果不設生物學重複,高影響因子的雜志可能會遭編輯質疑。不建議2個生物學重複是因為,如果兩者結果不一緻,無法确定以哪個數據為參考。3個生物學重複,如果出現1個結果不一緻的,可以取另外2個的結果。

Q2:RNA-Seq必須要有參考基因組序列嗎?

不是必須要有參考基因組序列,但一定要有參考序列,如unigene序列、mRNA序列、CDS序列等可以作為參考序列。也可通過參考有基因組序列的近緣物種的基因注釋信息來完成相應的标準信息分析,不過此種方法并不推薦。

Q3:RNA-Seq如果沒有參考序列怎麼解決?

推薦做轉錄組de novo組裝獲得unigene作為RNA-Seq參考序列。需要注意的是,要把所有做RNA-Seq的樣品,都混合成一個樣品,做轉錄組。

Q4:RNA-Seq推薦測序數據量與基因組大小有關嗎?

RNA-Seq推薦的測序數據量,主要與基因數量有關,不同物種基因組大小相差比較大,但是編碼基因的數量相差并不大,一般物種在3萬左右。所以對于一般物種的RNA-Seq數據量,10M clean reads是足夠的。一般HiSeq平台推薦10M clean reads數據量,BGISEQ-500平台,為了給研究者更準确全面的數據結果,提供20M clean reads,而價格比HiSeq平台10M clean reads數據量還低。

Q5:有些觀點認為RNA-Seq測序策略是SE100,有必要測這麼長嗎? PE測序是不是會比SE測序更好?

沒有必要,SE50足夠。做RNA-Seq,隻要将得到的reads比對到參考基因集,得到基因ID就可以了,不需要那麼長,因為不需要做組裝,也不需要做定性分析。文獻支持:康奈爾大學維爾醫學院的研究人員在Genome Biology雜志上發表文章[2]認為對于差異表達分析而言,讀長并非越長越好。研究人員認為,在RNA-seq研究中使用什麼樣的讀長,這要取決于研究的最終目的。如果隻需要差異表達基因,那麼50 bp的單端讀取就夠了。與100 bp的雙端讀取相比,使用50 bp的單端讀取能夠節省成本、時間。

Q6:測序後有何驗證方法?

實驗驗證的方法最常見的是通過實時熒光定量 PCR(qRT-PCR)技術來驗證測序結果。還有FISH(原位熒光雜交)、微陣列芯片技術、Northern blot等。 功能驗證一般是基因敲除、敲低或過表達,轉基因等。

Q7:BGISEQ-500 RNA-Seq有沒有發布demo數據?

已發布一個UHRR人标準品下機數據并共享了數據結果和分析方法,下載請點擊這裡>>


參考文獻

1. Kasper D Hansen, Zhijin Wu, et al. Sequencing technology does not eliminate biological variability. Nature Biotechnology. 2011. 29(7): 572–573.

2. Chhangawala S, Rudy G, Mason CE, et al. The impact of read length on quantification of differentially expressed genes and splice junction detection. Genome Biology. 2015 Jun 23;16:131.


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