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産品服務

Sequencing services

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真核轉錄組測序

       轉錄組測序,對某一物種或特定細胞在某一功能狀态下産生的mRNA進行高通量測序,既可以提供定量分析,檢測基因表達水平差異,又可以提供結構分析,能發現未知轉錄本和稀有轉錄本,精确地識别可變剪切位點、基因融合、SNP以及Indel位點等,而且不依賴于參考基因組。


技術優勢

任意物種的全轉錄組分析:無需預先設計特異性探針,因此無需了解物種基因或基因組信息,能夠直接對任何物種進行最全面的轉錄組分析;

覆蓋度高:數字化信号,直接測定幾乎所有轉錄本片段的序列;

檢測阈值寬:跨越6個數量級的寬檢測阈值,從幾個到數十萬個拷貝精确計數;

分辨率高:可以檢測基因家族中相似基因及可變剪接造成的單堿基差異;

檢測範圍廣:從幾個到數十萬個拷貝精确計數,可同時鑒定及定量正常和稀有的轉錄本。

産品應用

醫學上的應用方向——

圖片2

農學上的應用方向 ——

圖片1

 

研究内容

一、無參考序列物種

标準信息分析:

 1. 測序數據過濾

2. 轉錄組de novo組裝

3. Unigene七大功能數據庫注釋

4. Unigene的CDS預測

5. Unigene的TF編碼能力預測

6. Unigene的SSR檢測

7. Unigene表達量計算(基因表達水平、PCA分析、基因表達水平箱線圖和密度圖、樣品間的表達量韋恩圖)

8. 時間序列分析

9. 差異表達基因檢測

10. 差異表達基因聚類分析

11. 差異表達基因GO功能分析

12. 差異表達基因Pathway功能分析

13. 差異基因蛋白互作分析

14. 真菌緻病基因預測 (真菌樣本)

15. 植物抗病基因預測(植物樣本)

定制化信息分析:

1. 可結合客戶的需求,協商确定定制化信息分析内容。

 

二、有參考序列物種

标準信息分析:

1. 測序數據過濾

2. 參考基因組比對

3. 新轉錄本預測

4. SNP和INDEL檢測

5. 融合基因檢測(僅适用于人的癌症融合基因研究,每個樣本8G以上數據量)

6. 差異剪接基因檢測

7. 基因表達量計算(基因比對率及表達數目統計、Reads對轉錄本的覆蓋度及分布、樣品間的相關性、PCA分析、樣品中基因表達量的分布、樣品間及組間的基因表達情況)

8. SNP、INDEL、基因表達量和基因融合Circos圖(僅限人的樣本)

9. 基因表達量聚類分析

10. 時間序列分析

11. 差異表達基因檢測

12. 差異表達基因維恩圖分析

13. 差異表達基因層次聚類分析

14. 差異表達基因GO功能分析

15. 差異表達基因Pathway功能分析

16. 差異表達基因TF編碼能力預測

17. 差異表達基因蛋白互作分析

18. 差異表達基因中的真菌緻病基因預測(真菌樣本)

19. 差異表達基因中的植物抗病基因預測(植物樣本)

高級信息分析:

1. 基因共表達網絡分析(15個及以上樣品,不包含在标準執行周期内)

定制化信息分析 :

1. 可結合客戶的需求,協商确定定制化信息分析内容


醫學案例:轉錄組研究惡性腫瘤誘導分化

研究目的:研究惡性腫瘤誘導分化治療。

研究材料:人惡性膠質母細胞瘤細胞經化合物誘導0h, 6h, 12h, 24h和48h。

研究方法:轉錄組測序,每個樣本2.3-2.4Gb。

研究背景

         沃伯格效應(Warburg Effect)是惡性腫瘤的特征之一,是惡性腫瘤賴以生存的代謝模式。具體來說,絕大部分正常細胞在有氧的情況下以氧化代謝為主,而腫瘤細胞即使在氧供充足的情況下也會将葡萄糖優先進行糖酵解,為自身合成生物大分子提供必需的原料。

        惡性膠質母細胞瘤(GBM)占大腦惡性腫瘤的60%,即使接受手術、放療和化療的綜合療法,病人的中位生存期也不超過1年。

研究結果:

        1、在缺乏可靠治療手段的惡性膠質母細胞瘤上,本研究發現,逆轉這些細胞的沃伯格代謝模式,即将細胞從糖酵解為主轉變為氧化代謝為主(反沃伯格效應),可以使惡性細胞轉變為正常的星型膠質細胞。他們通過轉錄組和蛋白質組學數據分析發現,化合物誘導的膠質細胞與誘導前的惡性細胞相比較,差異顯著基因集中于線粒體生成和氧化磷酸化相關通路。

         2、進一步的實驗證實,化合物誘導惡性細胞出現代謝重編程,此效應由cAMP-PGC1α通路激活介導。PGC1α促進腫瘤細胞的線粒體生物合成增加,進而引起反沃伯格效應,即增強細胞氧化代謝和降低糖酵解。反沃伯格效應使腫瘤細胞的營養物質更多被氧化代謝所消耗,引起生物大分子合成缺乏原料,最終驅動腫瘤細胞的命運走向分化。

        3、此研究工作的重要意義在于,證實逆轉沃伯格效應可驅動惡性膠質母細胞瘤細胞向正常細胞方向分化,為惡性腫瘤誘導分化療法提供了新的策略。

                        圖片3

圖1  轉錄組和蛋白質組學數據發現化合物誘導的膠質細胞氧化代謝增

參考文獻:

 Xing F, Luan Y, Cai J, et al. The Anti-Warburg Effect Elicited by the cAMPPGC1α Pathway Drives Differentiation of Glioblastoma Cells into Astrocytes. Cell Reports. 2017 Jan 10;18(2):468-481.


農學案例:轉錄組測序構建大鲵的參考基因集

研究目的:構建大鲵完整的參考基因集。

研究材料:收集成年中國大鲵的20多個組織樣本(腹部皮膚、背部皮膚、側部皮膚、肺、心髒、腎、胰腺、小腸、脾髒、胃、腦、脊髓、軟骨、眼睛、指尖、長骨、上颌骨、頭蓋骨、肌肉、 卵巢、脂肪、尾部脂肪、血液)。

研究方法:轉錄組測序,每個樣本約為6.5Gb。

研究結果

1. 為了獲得一個完整的參考基因集,将所有樣本的clean reads混合在一起組裝得到93,366條非冗餘轉錄本,平均長度1,326bp。

2. 将組裝得到的序列注釋到NR、Swiss-Prot,KEGG、COG、GO數據庫進行功能注釋,最後有41,874條序列被注釋到。

3. 采用BlastX,ESTscan、Transdecoder 軟件分别預測CDS序列,然後再進行整合(至少2種方法支持),并且需要CPC≥1,最後鑒定了26,135個蛋白。

                                                      圖片16

圖2 轉錄組組裝評估

B: BUSCO評估基因集、C和D:和熱帶爪蟾、高山倭蛙比較CDS長度

參考文獻:

Geng X, Li W, Shang H, Gou Q, et al. A reference gene set construction using RNA-seq of multiple tissues of Chinese Giant Salamander, Andrias davidianus. Gigascience. 2017 Feb 15. doi: 10.1093/gigascience/gix006.

轉錄組測序信息分析2018升級版

部分升級内容展示:

 

                                             圖1 busco_figure (2)

圖1   單拷貝直向同源數據庫BUSCO評價組裝質量

 

                                    圖2 左 SNP SnpSummary[1]圖2 右 Splice AsSummary[1]

圖2  SNP類型、差異可變剪接數目堆積圖

 

                                                            圖3第一個圖HBRR-VS-UHRR圖3第二個圖HBRR2-VS-UHRR2_PossionDis_Method_network

 

                                圖3第三圖 第二排第一個HBRR2-VS-UHRR2圖3第四個圖 第二排第二個HBRR1-VS-UHRR1圖3第五個圖 第二排第三個Coexpression

圖3 GO、KEGG、蛋白互作網絡、轉錄因子和WGCNA的基因共表達等五大特色關系網絡圖

                           圖4 第一個圖 第一排左圖4 第二個圖 第一排右blue

                                 圖4 第三個圖 第二排左Modules_gene_black圖4 最後一個圖 第二排右

圖4  共表達基因模塊與樣品的相關性總覽圖,單個模塊的基因共表達網絡圖、GO和KEGG功能注釋


表1 真核轉錄組測序樣品判定标準

圖片5


Q1:BGISEQ-500滾環擴增技術的特點是什麼?

滾環擴增技術RCA的模闆始終是同段序列,擴增錯誤不會累積,與PCR指數擴增相比于保真優勢。

Q2:BGISEQ-500平台的測序原理是什麼?

BGISEQ-500采用優化的聯合探針錨定聚合技術(cPAS)和改進的DNA納米球(DNB)核心測序技術,是行業領先的高通量測序平台之一。具體而言,首先DNA分子錨和熒光探針在納米球上進行聚合,随後高分辨率成像系統對光信号進行采集,光信号經過數字化處理後即可獲得待測序列。其中,DNB通過線性擴增增強信号,降低單拷貝的錯誤率。而且,DNB大小與芯片上活性位點的大小相匹配,每個位點結合一個DNA納米球,在保證測序精度的情況下提高了測序芯片的利用效率。

Q3:BGISEQ-500 下機數據格式是什麼?

通用下機數據格式:(FASTQ)讓數據兼容性更好。

Q4:BGISEQ-500平台真核轉錄組推薦數據量?

推薦6G或者10G數據量;

Q5: 可否提供BGISEQ-500轉錄組标準品測試數據供客戶測評?

可以,我們 1個UHRR标準品,構建了3個文庫,數據都已經上傳到EBI。請點擊下面鍊接下載。http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB19428。

Q6: 可否提供BGISEQ-500真核轉錄組實驗流程英文版?

The first step in the workflow involves purifying the poly-A containing mRNA molecules using poly-T oligo-attached magnetic beads. Following purification, the mRNA is fragmented into small pieces using divalent cations under elevated temperature. The cleaved RNA fragments are copied into first strand cDNA using reverse transcriptase and random primers. This is followed by second strand cDNA synthesis using DNA Polymerase I and RNase H. These cDNA fragments then have the addition of a single 'A' base and subsequent ligation of the adapter. The products are then purified and enriched with PCR amplification.

We then quantified the PCR yield by Qubit and pooled samples together to make a single strand DNA circle (ssDNA circle), which gave the final library.

DNA nanoballs (DNBs) were generated with the ssDNA circle by rolling circle replication (RCR) to enlarge the fluorescent signals at the sequencing process. The DNBs were loaded into the patterned nanoarrays and pair-end read of 100 bp were read through on the BGISEQ-500 platform for the following data analysis study. For this step, the BGISEQ-500 platform combines the DNA nanoball-based nanoarrays and stepwise sequencing using Combinational Probe-Anchor Synthesis Sequencing Method.


 


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