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目标區域捕獲甲基化測序

       采用目标區域捕獲探針,對全基因組範圍内特定感興趣的區域進行捕獲(小至幾百K,大到幾百M),并結合甲基化測序金标準bisulfite轉化測序的方法,對捕獲區域内的C位點進行甲基化水平的檢測的一種技術,結合目标區域捕獲和Bisulfite測序的方法,不僅能夠在很大程度上降低研究的成本,還能夠提高目标區域的測序深度,從而增加檢測準确性,獲得檢測區域的單堿基分辨率的甲基化信息,适用于對已知的感興趣區域進行高深度甲基化檢測驗證和新的甲基化位點挖掘,該技術使得對全基因組内感興趣的目标序列和區域進行高通量高精度的甲基化檢測成為現實,在甲基化組學研究方面提供了一個全方位,穩定高效,高性價比的技術方法。

技術流程


技術優勢

覆蓋位點多:相比甲基化芯片(850K基因分型芯片)能獲得數倍的CpG位點;

檢測範圍廣:除了覆蓋已知的DMR區域之外,還能發現新的DMR區域;

精确度高:精确到單堿基分辨率,與已發表的全基因組甲基化測序數據有高度一緻性;

技術穩定:目标區域捕獲效率、測序深度分布、基因組覆蓋度的重複性高 。

靈活性好:可針對客戶感興趣的區域靈活定制,能夠設計100K~210M的區域 。

研究内容

标準信息分析

1. 數據基本處理與質控

2. 甲基化C堿基中CG, CHG 與CHH的分布比例

3. C位點的平均甲基化水平分析

4. 甲基化CG、CHG和CHH的甲基化水平分布

5. 不同基因組區域的甲基化分布特征

6. 不同功能元件甲基化水平分析

7. 差異甲基化DMR的檢測

8. DMR相關基因的GO和Pathway分析

定制化信息分析

可結合客戶的需求,協商确定定制化信息分析内容(如甲基化與轉錄組關聯分析等)。

 


案例一:DNA甲基化通過調控基因表達影響精子活力[1]

案例描述

        研究表明弱精症疾病與整體甲基化水平變化有關,但具體跟哪些基因有比較強的聯系, BGI與廣東省男性生殖與遺傳重點實驗室、北京大學深圳醫院合作,利用針對Promoter區域設計的目标捕獲甲基化測序技術,研究DNA甲基化與弱精症之間的關系。

部分研究結果

        此案例采用華大基因設計的Promoter捕獲kit,對7個弱精症患者和8個正常對照的精子進行了目标區域捕獲甲基化測序,鑒定出134個差異甲基化CpG、41個差異甲基化區域以及134個可變甲基化CpG位點。差異甲基化圖譜顯示低活力精子中基因的表達由DNA甲基化調控,經過基因功能分析,最終找到16個與精子形成、精子活力相關的基因。

 

圖1 差異甲基化基因的功能分析

案例二:目标區域捕獲甲基化測序揭示肝細胞癌的發生與機理[2]

案例描述

        在肝癌研究中,全基因組甲基化技術已有應用,為了更好的了解肝癌的發生,華大基因采用自主設計的Promoter捕獲kit,對肝細胞癌組織及其癌旁組織進行了更高分辨率的目标區域捕獲甲基化測序,聯合RNA-seq對相關候選基因進行篩選鑒定。

部分研究結果

        此案例采用華大基因設計的Promoter捕獲kit,對8個肝細胞癌組織及其癌旁組織進行了目标區域捕獲甲基化測序,并找到2972個DMR區域。後續通過聯合RNA-Seq結果進行分析,鑒定出12個DMR相關基因,并用BSP方法驗證了這12個基因的甲基化狀态,其中7個基因在大樣本量的群體(78對HCC樣品)中用BSP手段進行了驗證。案例聯合了RNA-Seq和Promoter甲基化測序的方法來發掘HCC的原癌基因和抑癌基因,并提供了一種性價比極高的表觀遺傳學研究方案。


圖2 癌組織和癌旁組織DMR聚類分析

參考文獻

1. Du Y, Li M, et al.Promoter targeted bisulfite sequencing reveals DNA methylation profiles associated with low sperm motility in asthenozoospermia. Hum Reprod. 2016 Jan.

2. Xiuqing Zhang, Liang H, et al. Global analysis of DNA methylation in hepatocellular carcinoma by a liquid hybridization capture-based bisulfite sequencing approach.Clin Epigenetics. 2015 Aug 21.


1、DMR的檢測

       差異甲基化區域(DMRs)是指不同樣品中基因組表現出不同的甲基化模式的某些DNA片段。 DMR與遺傳印記相關,在個體中表現為與父本或母本的甲基化狀态一緻。甲基化的等位基因經常表現為沉默狀态。親本與子代甲基化模式的差異常常導緻表觀遺傳缺陷,而人工繁殖技術可能會導緻異常甲基化的比例升高,并導緻疾病的發生。

圖1 DMRs中的差異甲基化水平分析

2、差異性甲基化區域(DMR)相關基因GO分析

       基因本體論(Gene ontology,GO)是所有物種中最主要的了解基因和基因産物屬性的生物信息學分析手段,GO分析能夠用于鑒定基因産物的性能,它包含了三類基因功能信息:細胞組分(Cellular Component),分子功能(Molecular Function)和生物學過程(Biological Process)。為了探讨表觀遺傳變異在通路和生物學過程中起到的作用,我們對DMR相關的基因進行了GO分析。

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圖2 DMR相關基因的GO聚類分析

3、差異性甲基化區域(DMR)相關基因Pathway分析

       KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是有關Pathway的主要公共數據庫,該數據庫整合了基因組、化學以及系統功能信息,特别是測序得到的基因集與細胞、生物體以及生态環境的系統性功能相關聯。所有樣品中的DMR相關基因均用KEGG數據庫進行分析。

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圖3 DMR相關基因的Pathway功能顯著性富集分析



樣品要求

•樣品類型:DNA樣品

•樣本起始量:Agilent芯片需3ug以上,Nimblegen芯片需1ug以上

•濃度需求:大于30ng/ul

 

推薦數據

•推薦數據量:≥50×


Q1:目标區域捕獲甲基化在項目開始之前需要考慮哪些因素?

首先要考慮選用哪種捕獲kit,目前成品Kit有三種,華大自主設計的Promoter捕獲kit(BGI Promotor Kit),以及另外兩種商業成品捕獲kit(Nimblegen SeaCap CpGiant Enrichment Kit /Agilent SureSelectXT Human Methyl-seq)。

Q2:目标區域捕獲甲基化适合什麼類型的項目和區域大小?

目标區域捕獲甲基化測序服務适合于大樣本量的高深度測序項目,在已有全基因組研究基礎上,對感興趣的區域進行高深度驗證或挖掘,定制捕獲Kit理論上可對任意感興趣的目标區域進行研究,但需設計捕獲探針,所以建議客戶至少有上百個樣本量才采用該技術,可大大節約成本,區域大小可定制100K-200M,選擇靈活,可滿足客戶多樣的研究需求。

Q3:可以對無參考基因組的物種進行研究嗎?

甲基化分析強烈依賴基因組的完整程度,基因質量的好壞直接影響後續的分析結果,因此更适合有完整基因組信息的物種。

Q4:推薦的數據量?

建議至少50×以上深度。

Q5:目标區域捕獲kit訂購需要多長時間?

一般成品kit訂購大約需要2個月,全定制的捕獲kit大約需要3個月,所以項目啟動前建議客戶先做好探針準備工作。

 


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