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産品服務

Sequencing services

ChIP-Seq

       染色質免疫共沉澱(ChIP)是在體内環境中研究蛋白質與DNA相互作用的經典實驗方法,廣泛應用于組蛋白修飾、特定轉錄因子的基因調控作用等相關領域。随着新一代測序技術的發展和成熟,染色質免疫沉澱實驗與高通量測序的整合——Chromatin Immunoprecipitation Sequencing (ChIP Sequencing ),可在全基因組範圍對蛋白結合位點進行高效而準确的篩選與鑒定,同時也為研究的深入開展打下基礎。

       采用特異性抗體對目的蛋白進行免疫沉澱後,分離與其結合的基因組DNA片段,再通過高通量測序與數據分析,在全基因組範圍内尋找目的蛋白的DNA結合位點,并且可以基于多個樣品進行差異比較。

技術流程



技術優勢

周期更短:交付快至25個工作日

低起始量:BGISEQ-500平台最低起始量僅需5ng,5ng以下亦可做定制化

準确性高:BGISEQ-500與HiSeq平台一緻性相關系數高達0.99

關聯分析:可定制 ChIP-Seq與RNA-Seq差異表達基因(DEGs)關聯分析


研究内容

1)   數據過濾質控;

        a)   數據産出統計

        b)   質量、堿基比例分布圖

2)   ChIP 測序序列與參考基因組序列的比對(基于1);

        a)  比對結果統計

        b)  基因組測序深度累積分布

        c)  基因測序深度分布

3)   Peak 分析(基于2);

        a)   Peak掃描

        b)   Peak長度分布

        c)   Peak深度分布

4)   Peak注釋(基于3);

        a)  Peak在基因功能元件上的分布

        b)  Peak相關基因分析

        c)  Peak相關基因的GO功能顯著性富集分析

        d)  Peak相關基因的Pathway功能顯著性富集分析

5)   鑒定樣品間差異Peak(基于2,3);

        對兩個樣品進行差異分析,确定存在樣品間差異修飾的區間。

6)   樣品間差異Peak注釋(基于5);

        a) 差異Peak的基因功能元件分布

        b) 差異Peak相關基因分析

        c) 差異Peak相關基因的GO功能顯著性富集分析

        d) 差異Peak相關基因的Pathway功能顯著性富集分析

7)   免費提供UCSC genome browser 使用說明(基于2,3)。

定制化信息分析

        可結合客戶的需求,協商确定定制化信息分析内容(如甲基化與轉錄組關聯分析等)。


案例一:BGISEQ-500 ChIP-Seq在乳腺癌轉移研究中的應用[1]

案例描述: 乳腺癌是人類常見的一種惡性腫瘤,據統計,全球每年新發乳腺癌高達120萬人,是女性第一高發的腫瘤,近年來我國的乳腺癌發病率明顯增高,而乳腺癌轉移是導緻患者死亡的主要原因,乳腺癌轉移的分子機理目前還不完全清楚,在以往的研究中觀察到FOXN3在其他惡性腫瘤中表達失調的現象,但FOXN3在惡性腫瘤(包括乳腺癌)發生中的作用及分子機理仍有待研究,它的功能又需要哪些分子共同作用。

發表單位:北京大學醫學部 尚永豐院士

影響因子:12.784

研究技術:(BGISEQ-500 ChIP-Seq)染色質免疫共沉澱測序、(iRIP-Seq)RNA免疫共沉澱測序等。

研究成果:

揭示了FOXN3-NEAT1-SIN3A阻遏物複合體的存在方式;

全基因組範圍内鑒定了FOXN3-NEAT1-SIN3A阻遏物複合體的目标基因;

FOXN3-NEAT1-SIN3A阻遏複合體促進乳腺癌細胞的EMT轉化和侵襲;

FOXN3-NEAT1-SIN3A阻遏物複合體促進乳腺癌的轉移;

FOXN3和NEAT1在乳腺癌中上調,其高水平與較高的腫瘤分級和較差的存活率相關。

部分結果展示:

圖1  A.FOXN3 iRIP-Seq顯著富集lncRNA分析結果;B. iRIP-Seq結果qPCR驗證結果; C.LncRNA表達芯片檢測散點圖


案例二:肝細胞中TCF7L2全基因組靶基因調控機制研究[2]

案例描述:TCF7L2在肝髒中代謝通路中具有重要作用,之前的研究發現TCF7L2在成千上萬個基因區域有富集,但具體哪一個才是重要的結合位點有待挖掘。

研究思路:

 

 圖2 文章研究思路

研究結果:TCF7L2沉默後實時RNA-Seq檢測3-96h有406個差異表達基因,進一步結合ChIP-Seq peak相關系數PPS大于10的直接調控Gene有149個,确定TCF7L2參與九大通路調控,其中包括脂質,碳水化合物和氨基酸以及尿素代謝途徑等。

chip-Seq-3

圖3 TCF7L2 peak proximity scores與DEGs表達差異值趨勢圖

chip-Seq-4

圖4 不同時期peak proximity scores與DEGs關系分布圖

參考文獻

[1]Yongfeng Shang,Yu Zhang,et al.The FOXN3-NEAT1-SIN3A repressor complex promotes progression of hormonally responsive breast cancer. J Clin Invest. 2017 Aug.

[2]Luke N., et al. (2014) The mechanisms of genome-wide target gene regulation by TCF7L2 in liver cells. Nucleic Acids Research, 2014, Vol. 42, No. 22 13647.


BGISEQ-500 ChIP-Seq平台及建庫技術簡介

1. 平台介紹

BGISEQ-500平台已經廣泛用于DNA、RNA測序,基于此平台不斷有高分文章産出。BGISEQ-500測序平台有五大關鍵的技術:DNB、Pattern array、cPAS、MDA-PE、sCMOS,保證了該平台測序的準确性。

與其他二代測序技術相比較,DNB測序技術具有以下幾個優勢:

(1)   DNB通過增加待測DNA的拷貝數而增強了信号強度,從而提高測序準确度;

(2)不同于PCR指數擴增,滾環擴增技術的擴增錯誤不會累積;

(3)DNB與芯片上活化位點的大小相同,每個位點隻固定一個DNB,保證信号點之間不産生相互幹擾;

(4)陣列化測序芯片和DNB測序技術的結合,使得成像系統像素和測序芯片的面積得到最大化利用。

2. 建庫技術


圖1  BGISEQ-500平台ChIP-Seq建庫測序流程圖

BGISEQ-500 ChIP-Seq數據展示

1. 與HiSeq測序平台一緻性相關系數高達0.99

 

圖2  BGISEQ-500平台與HiSeq平台ChIP-Seq結果一緻性評估

2. 測序重複性高達0.98


           圖3  BGISEQ-500平台ChIP-Seq測序重複性評估               圖4 HiSeq平台ChIP-Seq測序重複性評估

     3. 全面的信息分析,蛋白位點無處可逃


                     圖5 peak在基因功能元件上的分布分析                                圖6 peak相關基因的GO功能顯著性富集分析 

樣品要求

樣品類型:DNA 樣品;

總量:≥ 10 ng ChIPed DNA(人類樣本可以低至5ng);

濃度:≥ 1 ng/μL;

純度:OD260/280= 1.8 -2.0;

DNA片段大小:分布在100~500 bp範圍,且主帶明顯。請提供DNA打斷後的檢測膠圖以确定DNA片段大小是否符合要求,并請附加一份詳細的樣品信息單并提供ChIP後的q-PCR驗證結果;

執行周期

 46個樣本以下,25個工作日(BGISEQ-500平台)

推薦數據

推薦數據量:  20M或40M clean reads。


Q1:BGISEQ-500RS測序儀簡介?

BGISEQ-500RS基因測序儀是華大基因自主研發的首款桌面型、高通量測序系統BGISEQ-500科研專用系列,專為科研應用優化,普遍适用于基因組測序、轉錄組測序、表觀基因組測序等新一代高通量測序(NGS)領域。數據質量精準、測序流程精簡,是華大首推的NGS測序平台。

Q2:BGISEQ-500平台的測序原理是什麼?

BGISEQ-500采用優化的聯合探針錨定聚合技術(cPAS)和改進的DNA納米球(DNB)核心測序技術,是行業領先的高通量測序平台之一。具體而言,首先DNA分子錨和熒光探針在納米球上進行聚合,随後高分辨率成像系統對光信号進行采集,光信号經過數字化處理後即可獲得待測序列。其中,DNB通過線性擴增增強信号,降低單拷貝的錯誤率。此外,DNB大小與芯片上活性位點的大小相匹配,每個位點結合一個DNA納米球,在保證測序精度的情況下提高了測序芯片的利用效率。

Q3:BGISEQ-500平台通量如何?

每台儀器有2 slide/run, 2 lane/slide;每個lane 可以完成16個ChIP-Seq(20M clean reads);一個run可以安排1-2張slides。所以該平台更靈活,更容易湊run上機,縮短等待時間。

Q4:BGISEQ-500 ChiP-Seq産品優勢是什麼?

a)      準确性高:高深度Peaks與HiSeq平台一緻性高達到100%

b)      起始量低:樣品起始量低至5ng

c)      周期更短:交付快至25個工作日

d)      性價比高:相同的測序質量,價格更優惠

e)      關聯分析:ChIP-Seq與RNA-Seq差異表達基因(DEGs)關聯分析

Q5:對樣本起始量有沒有要求?

建庫起始量為5ng,建議ChIP-ed DNA≥ 20ng,低于5ng也可以做,之前有做過無濃度樣本成功的案例,但這類項目隻能客戶自己承擔建庫風險。

也可送細胞樣品,如果客戶送的是細胞樣品,細節參照《合作夥伴送樣建議》 ,且富集實驗走定制化評估流程

Q6:測序策略是什麼?

SE50

Q7: ChIP-Seq的對照中input和IgG有什麼不同嗎?

Input對照:在進行免疫沉澱前,需要取一部分斷裂後的染色質做Input對照。Input是斷裂後的基因組DNA,不加抗體做富集,但是需要與沉澱後的樣品DNA一起經過逆轉交聯,DNA純化,以及最後的PCR或其他方法檢測。Input對照不僅可以驗證染色質斷裂的效果,還可以根據Input中的靶序列的含量以及染色質沉澱中的靶序列的含量,按照取樣比例換算出ChIP的效率,所以Input對照是ChIP實驗必不可少的步驟。

陰性對照:用普通的IgG做為抗體(目的蛋白抗體宿主的IgG或血清)。理論上不會ChIP下來任何DNA片段,因此作為陰性對照,但是由于非特異結合,或者實驗過程中,沒發生結合的DNA清除不完全,可能也會出現條帶,如果非常明顯,那就證明實驗過程有待改進。

Q8:推薦多少數據量?能否接不同數據量的項目?

BGISEQ-500 ChIP-Seq推薦20M clean reads/樣本,其他類型數據量也可提供。

Q9:N-ChIP和X-ChIP的區别是什麼?

N-ChIP基于核酸内切酶MNase酶切,切割核小體且作用溫和,較适用于組蛋白修飾研究;X-ChIP基于甲醛固定,超聲打斷,适用于大多數蛋白-DNA相互作用研究。

Q10:樣品制備過程是否需要PCR擴增?PCR擴增後是否會影響最後的結果?

基于第二代測序平台的ChIP-Seq在樣品制備過程中需要進行PCR,但是隻需要非常少的反應次數,由于PCR引起的偏向性非常小。另外,在測序結果出來後,針對reads的比對結果,通過信息分析手段可以去除duplication的影響。我們的所有信息分析結果都是在去除duplication之後進行生物學意義挖掘的。根據我們的經驗,如果您送的樣品是直接ChIP富集的DNA,在我們的樣品制備後出現duplication的reads比例不會超過全部reads産量的5%。如果您送的樣品在ChIP富集後有做過PCR擴增,那麼這一步的PCR對結果的duplication影響非常嚴重。

Q11:哪些因素會影響ChIP-Seq的結果?

抗體的質量與特異性、需要富集的目标區域在基因組上的比例、ChIP的實驗操作、DNA片段長度範圍等都會影響ChIP-Seq的結果。

Q12:如果客戶自己富集的樣品濃度過低,需要将細胞系或組織樣品送到華大進行富集實驗時,客戶需要提供哪些信息?

客戶首先要把抗體送到華大進行評估,同時提供抗體信息:抗體公司(要求ChIP級抗體),貨号,産品說明書;抗體評估通過後,老師需要提供細胞系和驗證引物給華大進行富集實驗。


深圳華大科技(總部)

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