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産品服務

Sequencing services

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細菌 de novo 測序

産品介紹

       細菌基因組de novo是對細菌基因組測序後從頭組裝。步驟為先将細菌的染色DNA機械地随機切割成一定相對分子質量範圍的片段,根據不同的測序策略,構建對應大小文庫,然後進行大規模測序。最終的組裝水平根據研究的需要和細菌本身的特點而定,其中最高的指标是一條contig,即基因組的完整序列。

       在組裝的基礎上,進行基因組組分分析,功能注釋等分析,推測ORF是否為真實蛋白編碼序列,檢查功能位點,分析共有序列或特征序列、單個基因或基因間相互作用、表達調控等功能,細菌de novo測序已取代傳統方法成為研究細菌進化遺傳機制,關鍵功能基因的重要工具。可以預測重要基因和蛋白以了解其功能和可能機制;在研究病原菌的緻病性與疾病的預防和治療方面,可以鑒定緻病相關基因、開發和研究疫苗、開發新型抗生素等;在研究細菌進化方面,可以研究種内進化關系。

産品優勢

平台多樣:多平台聯合應用打造“極緻完成圖”

交付快速:有完善的分析流程,一鍵式交付,周期短

附加值高:結題報告文章化,深入挖掘基因組信息

經驗豐富:已完成上萬個細菌denovo項目,發表細菌基因組文章170多篇。

個性化分析:依據客戶需求制定個性化信息分析方案

 技術流程

測序策略

小片段文庫

Mate-pair 文庫

PacBio 20Kb文庫

細菌denovo

初級組裝

1

0

0

高級組裝

1

1

0

完成圖

1

0

1

信息分析内容

信息分析條款

信息分析内容

基因組組分分析

  • 基因成分
  • 重複序列
  • 非編碼RNA
  • CRISPR
  • 前噬菌體
  • 基因島

基因功能分析

  • 通用功能注釋(默認KEGGSwissProtGO,可選NrCOG)
  • 動物病原細菌緻病性和耐藥性分析(适用動物病原細菌)

  1. III型分泌系統效應蛋白預測(革蘭氏陰性菌)
  2. 病原與宿主互作數據庫(PHI)注釋
  3. 細菌緻病菌毒力因子(VFDB)注釋
  4. 耐藥基因(ARDB)注釋

  • 植物病原細菌緻病性分析(适用植物病原細菌)

  1. III型分泌系統效應蛋白預測(革蘭氏陰性菌)
  2. 病原與宿主互作(PHI)數據庫注釋
  3. 碳水化合物相關酶(CAZy)數據庫注釋

比較基因組分析(需要參考序列)

  • 結構變異(共線性)
  • 共有基因和特有基因
  • 物種進化(基于共有基因和特有基因或基因家族構建系統進化樹)
  • 基因家族

定制化分析

  • 可結合客戶的需求,協商确定信息分析内容


案例一:鼠疫杆菌遺傳多樣性研究

Historical variations in mutation rate in an epidemic pathogen, Yersinia pestis

期刊:PNAS 發表時間:2013

案例描述:

       鼠疫(plague)是鼠疫杆菌(Yersinia pestis,Y pestis)借鼠蚤傳播為主的烈性傳染病,是廣泛流行于野生齧齒動物間的一種自然疫源性疾病,也叫做黑死病。臨床上表現為發熱、嚴重毒血症症狀、淋巴結腫大、肺炎、出血傾向等。鼠疫在世界曆史上曾有多次大流行,在3個有記載的大流行期間導緻了大約2億人死亡,因此被冠上"最具毀滅性傳染病"的名頭。三次大流行第一次發生在公元6世紀,從地中海地區傳入歐洲,死亡近1億人;第二次發生在14世紀,波及歐洲、亞洲和非洲;第三次是18世紀,傳播32個國家。14世紀大流行時波及中國。鼠疫杆菌是鼠疫的病原體,過去的研究表明其由于起源較近,遺傳多樣性非常有限。

研究結果:

  • SNP突變率分析

    鑒定出的2,326個單核苷酸多态性(SNPs)中有2,298個SNPs,在進化譜系中僅出現過一次,并根據此構建了MSTree。

  • 鼠疫傳播路徑分析

    系統進化樹分析結果表明鼠疫起源于中國的青藏高原,其傳播途徑類似于古代絲綢之路及茶馬古道的線路,表明鼠疫的傳播與人類活動密切相關。

案例二:結核分枝杆菌群體進化和耐藥分析

Genome  sequencing  of  161 Mycobacterium  tuberculosis isolates  from  China  identifies genes and intergenic regions associated with drug resistance

期刊:Nature Genetics 發表時間:2013

材料與背景:

       中國12個省份的161株結核分枝杆菌(其中44株敏感菌,94株多耐藥菌,23株泛耐藥菌)

結果分析:

1. 通過本項研究,獲得了我國臨床耐藥結核分枝杆菌中已知耐藥相關基因的突變情況,新發現了與結核分枝杆菌耐藥性相關的72個編碼基因和28個基因間隔區的突變。

2. 中國地區的結核病人主要受到lineage 2  和lineage 4兩系結核分枝杆菌的侵染,而且,其中95%的lineage 2  結核分枝杆菌屬于國際上比較關注的北京家族。北京家族的結核分枝杆菌一直被認為有更強的毒性和更容易産生耐藥性。

圖1.  結核分枝杆菌系統進化分析。從中國12個省份中收集的161結核分枝杆菌的進化分析圖。其中,灰色菌株名代表以前公布過的結核分枝杆菌株,藍色菌株名代表敏感結核分枝杆菌株,黑色菌株名代表多耐藥(MDR)結核分枝杆菌株,粉紅色菌株名代表廣泛耐藥(XDR)結核分枝杆菌株。



DNA樣本要求

二代測序

樣本類型

總量

濃度

完整性(膠圖)

純度

基因組DNA

≤800bp 文庫

1μg

12.5ng/μl

主峰>20Kb

無蛋白,RNA/鹽離子等污染,樣本無色透明不粘稠

2-6Kb mate pair 文庫

20μg

100ng/μl

10Kb mate pair 文庫

30μg

70ng/μl

主峰>40Kb

≤800bp PCR free 文庫

10μg

30ng/μl

主峰>20Kb

 質粒,PCR産物等

≤800bp 文庫

1μg

12.5ng/μl

條帶清晰無彌散

無蛋白,RNA/鹽離子等污染,樣本無色透明不粘稠

≤800bp PCR free 文庫

3μg

30ng/μl


三代測序

樣本類型

總量

濃度

OD

完整性(膠圖)

純度

基因組DNA

微生物

20Kb 文庫

≥8μg

≥60ng/μL

OD260/280: 1.6-2.2;OD260/230: 1.5-2.3

無降解或輕微降解(主峰在40K附近且彌散不低于20Kb)

無蛋白,RNA/鹽離子等污染,樣本無色透明不粘稠



Q1. 現在細菌完成圖是否會限制基因組大小、GC含量、質粒情況,是否交付質粒信息?

答:目前細菌完成圖不再限制基因組大小、GC含量、染色體數目及質粒情況;無需提前評估,都可以按照完成圖的策略進行操作(基因組遠大于10M的細菌仍需慎重對待);除了交付基因組組裝結果以外還可以從組裝結果中識别出質粒序列,并判斷是否成環,挖掘質粒相關信息。

基因組大小在10M以内(包括10M或略高于10M)的細菌都可以選擇以下策略:

PacBio:20Kb文庫,1cell;HiSeq:350bp文庫,1G測序數據。

以上針對RSII平台執行的項目,如選擇sequel平台,pooling測序會影響質粒組裝

Q2. 華大細菌完成圖産品有哪些優勢?

答:華大細菌完成圖目前是用PacBio RSII平台進行測序,無pooling測序,測序産量高,讀長長,無樣本間交叉污染。

産品組裝指标高于同行标準。除了一般承諾的“1 contig, 0gap”,還可以進行以下分析:

成環判定:明确判定細菌基因組序列數目及是否成環

零點确定:确定環狀細菌基因組序列起始位點,便于序列比對分析

質粒識别:組裝結果中識别出質粒序列,并判斷是否成環,挖掘質粒相關信息

甲基化分析:基于三代測序進行甲基化位點分析及對應的motif序列分析

表1. 組裝結果示例

樣本名

染色體數目

Total length (bp)

GC含量(%

ID: circular/linear: length

2

5,706,418

45.68

Chromosome_1: circular:3383737

Chromosome_2: circular:2322681

2

7,699,152

70.36

Chromosome_1: linear:7685618

Plasmid_1: circular: 13534

1

10,397,305

70.82

Chromosome_1: linear:10397305


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